Μελέτη του ρόλου των φυλετικών ορμονών στην παθογένεια του συνδρόμου Sjogren: ανάλυση της έκφρασης οιστρογονικών υποδοχέων και της αποκρισιμότητας στα οιστρογόνα των επιθηλιακών κυττάρων των σιελογόνων αδένων

Abstract

Sjögren syndrome (SS) or autoimmune epithelitis is a chronic autoimmune disorder ofthe exocrine glands, mainly of the salivary and the lacrimal glands, that affects about1-3% of the general population and is characterized by strong female preponderance.Experimental evidence suggests that salivary gland epithelial cells (SGEC) are centralto the autoimmune lesion in SS, not only as target cells, but also as an activeparticipant in the induction and perpetuation of the autoimmune response. SGECappear to actively participate in immune responses and to possess immune function,whereas the perturbation of this function possibly contributes to the development ofthe autoimmune response in the context of the chronic activation of the epithelium.The strong female preponderance of the disease (women/men 9:1), as well as theusual occurrence of the disease around menopause led to the classic hypothesis thatestrogens are central to the pathophysiology of the disease, whereas experimentalanimal models have indicated the contribution of estrogens in disease pathogenesis.Experimental and epidemiological data indicate the paramount importance of bothSGEC and estrogens in SS pathogenesis, as well as that the salivary gland is normalysubjected to estrogenic influence. However, the expression and functional capacity ofestrogen receptor alpha and estrogen receptor beta (ERα and ERβ) in normal humansalivary epithelium as well as the estrogenic responsiveness and the expression ofERα and ERβ in the salivary epithelium of SS patients has not been assessed.In the present study, the expression and functional capacity of ERα and ERβ,the immunomodulatory potential of estrogens and the estrogenic effect in theproliferation and the induction of apoptosis in SGEC was initially assessed in normalsalivary epithelium. After the detection of the expression and of the functionalcapacity of ERα and ERβ proteins in normal salivary epithelium, the estrogenic responsiveness and the expression of ERα and ERβ proteins was comparativelyassessed in the salivary epithelium of SS patients and of healthy controls. Theexpression of ERα and ERβ proteins and their isoforms (ERαΔ3-isoform, ERβ1-long[currently regarded as the wild-type ERβ protein] and ERβ1-short forms and ERβ2-isoform) was analysed in tissue specimens (immunohistochemical experiments), aswell as in cultured non-neoplastic SGEC lines (immunohistochemical andimmunoblotting experiments), derived from minor salivary gland biopsies, frompatients that had undergone biopsy during their diagnostic evaluation for possible SS.Immunohistochemical experiments revealed strong expression of ERα, ERβ1 andERβ2 proteins, with similar staining pattern and intensity in both the nucleus andcytoplasm of SGEC. The epithelial expression of estrogen receptors was confirmedby immunoblotting experiments in cellular extracts from SGEC, where the full-lengthERα and the ERα-Δ3 isoform, ERβ1-long, ERβ1-short and ERβ2-long proteins weredetected. The application of a standard estrogenic inhibition assay of cytokine inducedadhesion molecules expression revealed that normal SGEC are responsive toestrogens, as well as the functional capacity of ERα and ERβ. The modulation ofconstitutive and IFNγ-induced CD54/ICAM.1 molecules expression by treatment withestrogenic agonists was analyzed by flow cytometry. In this assay the pretreatment ofcultured SGEC with 17β-estradiol [Ε2] and the selective ERα- and ERβ- agonistspropylpyrazole-triol [PPT] and diarylpropiolnitrile [DPN] respectively, inhibited theIFNγ-induced surface expression of intercellular adhesion molecule-1(CD54/ICAM.1). The above described findings have indicated the constitutiveexpression of functional ERα and ERβ proteins by normal salivary epithelium, thatapparently mediate immunomodulatory effects. E2 as well as selective ERα- and ERβ- agonists were not found to modulate constitutive ICAM.1 expression, theproliferation rate or the apoptosis in normal cultured SGEC.The estrogenic responsiveness of the SGEC of SS-patients was then evaluated.For this purpose, cultured SGEC-lines derived from SS-patients and from controlindividuals were comparatively evaluated in the standard estrogenic inhibition assaythat was described above. Constitutive ICAM.1 expression was not modulated byestradiol treatment in either the control- or the SS-SGEC lines. In line with our initialresults, in control SGEC E2-pretreatment resulted in siginificant inhibition of theIFNγ-induced ICAM.1 expression. However, such inhibitory effect was not observedin the SS-SGEC lines. This defective estrogenic responsiveness did not appear tocorrelate with the expression of ERα and ERβ proteins and their isoforms, as nodifferences in the pattern or intensity of ERα and ERβ proteins were observedbetween the salivary epithelial cells of SS-patients and those of control individuals.In conclusion, the present study has indicated the expression of functionalERα and ERβ proteins in normal salivary epithelium. Estrogens appear to modulatethe epithelial responses to inflammatory stimuli as suggested by the inhibition ofIFNγ-induced ICAM.1 expression by 17β-estradiol and selective ERα- and ERβ-agonists. Estrogen responsiveness of cultured SGEC derived from patients with SSwas found significantly reduced, a finding that did not appear to correlate with theexpression pattern of ERα and ERβ proteins.On the basis of the immunoregulatoryproperties of estrogens, the reduced responsiveness of of SGEC of SS patients to 17β-estradiol, may be also of direct pathophysiological relevance, possibly reflecting theperturbed immunological function of SGEC in SS, and may well be a functionalmanifestation of constitutively active cellular mechanisms that apparently operate inthe epithelia of SS patients.

Το σύνδρομο Sjögren (σS) ή αυτοάνοση επιθηλιΐτιδα αποτελεί μια χρόνια αυτοάνοσηδιαταραχή των εξωκρινών αδένων, κυρίως των σιελογόνων και δακρυϊκών, η οποίαπροσβάλλει περίπου το 1-3% του γενικού πληθυσμού και χαρακτηρίζεται από τηνέντονη παθογενετική συμμετοχή του γυναικείου φύλου. Πολλαπλά πειραματικάδεδομένα υποδεικνύουν τα επιθηλιακά κύτταρα των σιελογόνων αδένων (ΕΚΣΑ) ωςτο κέντρο της βλάβης στο σS όχι μόνο σαν κύτταρο στόχο, αλλά και σαν ενεργόσυμμέτοχο στην επαγωγή και την διατήρηση της αυτοάνοσης ανοσολογικήςαπόκρισης. Φαίνεται ότι τα ΕΚΣΑ συμμετέχουν στις ανοσολογικές αποκρίσεις καιδιαθέτουν ανοσολογική λειτουργία ενώ η διαταραχή αυτής της λειτουργίας μπορεί νασυμμετέχει στην ανάπτυξη χρόνιων αυτοανόσων αποκρίσεων στα πλαίσια χρόνιαςενεργοποίησης του επιθηλίου. Ο εξαιρετικά μεγαλύτερος αριθμός των γυναικώνμεταξύ των ατόμων που προσβάλλονται (αναλογία γυναίκες/άνδρες: 9:1), καθώς καιη εμφάνιση της νόσου κατά την περίοδο της εμμηνόπαυσης έχει οδηγήσει στηνκλασσική υπόθεση ότι τα οιστρογόνα ασκούν σημαντική επίδραση στηνπαθοφυσιολογία της νόσου, ενώ πειραματικά ζωικά πρότυπα υποδεικνύουν τησυμμετοχή των οιστρογόνων στην παθογένεια του σS. Τα πειραματικά καιεπιδημιολογικά δεδομένα λοιπόν υποστηρίζουν ότι τόσο τα ΕΚΣΑ όσο και ταοιστρογόνα κατέχουν κεντρικό ρόλο στην παθογένεια του σS καθώς και ότι τοεπιθήλιο των σιελογόνων αδένων φυσιολογικά υπόκειται σε οιστρογονική ρύθμιση.Εντούτοις, η έκφραση και η λειτουργική ικανότητα των οιστρογονικών υποδοχέων(οιστρογονικός υποδοχέας α [estrogen receptor alpha-ERα]) και βήτα [estrogenreceptor beta-ERβ]) στο φυσιολογικό ανθρώπινο επιθήλιο σιελογόνων αδένων καθώςκαι η δυνατότητα οιστρογονικής απόκρισης και η έκφραση των ERα και ERβ στοεπιθήλιο των σιελογόνων αδένων στους ασθενείς με σS δεν έχει μελετηθεί. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε, αρχικά στο φυσιολογικό επιθήλιο τωνσιελογόνων αδένων, η έκφραση και η λειτουργική ικανότητα των υποδοχέων ERα καιERβ, η δυνατότητα ανοσορυθμιστικής επίδρασης των οιστρογόνων, καθώς και ηπιθανή επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό και την επαγωγή απόπτωσης σταΕΚΣΑ. Αφότου εξακριβώθηκε η έκφραση και η λειτουργική ικανότητά των ERα καιERβ στο φυσιολογικό επιθήλιο σιελογόνων αδένων, μελετήθηκε συγκριτικά στοεπιθήλιο των σιελογόνων αδένων από ασθενείς με σS και από υγιείς μάρτυρες ηδυνατότητα οιστρογονικής απόκρισης καθώς και η έκφραση των πρωτεϊνών ERα καιERβ.Προκειμένου να διερευνηθεί η έκφραση των ERα και ERβ και ισομορφώντους (η ισομορφή ERαΔ3, η long μορφή του ERβ1 [η οποία θεωρείται η wild typeπρωτεΐνη] και η short μορφή του ERβ1, και η ERβ2 ισομορφή), αναλύθηκανιστολογικές τομές (με ανοσοϊστοχημεία) καθώς και καλλιεργημένες μηνεοπλασματικές σειρές ΕΚΣΑ (με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοαποτύπωση), οι οποίεςπροέρχονται από βιοψίες επικουρικών σιελογόνων αδένων, από ασθενείς πουυπεβλήθησαν σε βιοψία στα πλαίσια διαγνωστικής διερεύνησης για πιθανή ύπαρξησS. Τα πειράματα ανοσοϊστοχημείας ανέδειξαν ισχυρή έκφραση των πρωτεϊνών ERα,ERβ1 και ERβ2, με παρόμοιο πρότυπο και ένταση χρώσης στο κυτταρόπασμα και τονπυρήνα των ΕΚΣΑ. Η επιθηλιακή έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέωνεπαληθεύτηκε με ανοσοαποτύπωση σε κυτταρικά εκχυλίσματα από καλλιεργημέναΕΚΣΑ, στα οποία ανιχνεύθηκαν οι πρωτεΐνες full-length ERα καθώς και η ισομορφήERα-Δ3, η wild type πρωτεΐνη ERβ1-long, και η short μορφή του ERβ1 καθώς και ηισομορφή ERβ2 (η long μορφή). Η εφαρμογή μίας καθιερωμένης δοκιμασίαςοιστρογονικής αναστολής της επαγόμενης από κυτταροκίνες έκφρασης μορίωνκυτταρικής προσκόλλησης, ανέδειξε τη αποκρισιμότητα των φυσιολογικών ΕΚΣΑ στα οιστρογόνα, καθώς και τη λειτουργική ικανότητα των ERα και ERβ. Σε αυτήν τηδοκιμασία η προεπώαση των καλλιεργημένων ΕΚΣΑ με 17β-οιστραδιόλη [Ε2] καιτους εκλεκτικούς αγωνιστές για τον ERα και τον ERβ propylpyrazole-triol [PPT] καιdiarylpropiolnitrile [DPN] αντίστοιχα, ανέστειλε την επαγωγόμενη από τηνιντερφερόνη-γ [ΙΦΝγ] επιφανειακή έκφραση του διακυτταρικού μορίουπροσκόλλησης -1 [intercellular adhesion molecule-1 CD54/ICAM.1]. Η τροποποίησητης αυθόρμητης και της επηγμένης από την ΙΦΝγ έκφρασης μορίων CD54/ICAM.1μετά από επώαση με οιστρογονικούς αγωνιστές αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής.Τα παραπάνω ευρήματα ανέδειξαν την αυθόρμητη έκφραση λειτουργικών πρωτεϊνώνERα και ERβ από το φυσιολογικό επιθήλιο των σιελογόνων αδένων οι οποίοιμάλιστα φαίνεται ότι μπορούν να διαμεσολαβούν και ανοσορυθμιστικές δράσεις. ΗΕ2 καθώς και οι εκλεκτικοί αγωνιστές για τον ERα και τον ERβ δεν βρέθηκε νατροποποιούν την αυθόρμητη έκφραση ICAM.1, το ρυθμό αύξησης ή το ποσοστόαπόπτωσης στα φυσιολογικά καλλιεργημένα ΕΚΣΑ.Έπειτα, μελετήθηκε η αποκρισιμότητα των ΕΚΣΑ των ασθενών με σS σταοιστρογόνα. Για το συγκεκριμένο σκοπό αναλύθηκαν συγκριτικά καλλιεργημένες μη-νεοπλασματικές σειρές ΕΚΣΑ από ασθενείς με σS (σS-ΕΚΣΑ) και από υγιείςμάρτυρες (control-ΕΚΣΑ) με την δοκιμασία οιστρογονικής αναστολής πουπεριγράφηκε παραπάνω. Η αυθόρμητη έκφραση ICAM.1 δεν τροποποιήθηκε από τηνΕ2 ούτε στις control- ούτε στις σS-σειρές ΕΚΣΑ. Σε ακολουθία με τα αρχικάαποτελέσματα, στα control-ΕΚΣΑ η προεπώαση με E2 οδήγησε σε σημαντικήαναστολή της επαγωγής του ICAM.1 από την ΙΦΝγ. Στις σειρές ΕΚΣΑ πουπροέρχονταν από ασθενείς με σS όμως δεν παρατηρήθηκε οιστρογονική αναστολή. Ημειωμένη οιστρογονική απόκριση των σS-ΕΚΣΑ δεν βρέθηκε να συσχετίζεται με τηνέκφραση των πρωτεϊνών ERα και ERβ και των ισομορφών τους, εφόσον δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στο πρότυπο ή την ένταση της έκφρασης των πρωτεϊνώνERα και ERβ στα επιθήλια των σιελογόνων αδένων των ασθενών με σS και τωνυγιών μαρτύρων.Εν κατακλείδι, η παρούσα εργασία ανέδειξε την έκφραση λειτουργικώνυποδοχέων ERα και ERβ από το φυσιολογικό ανθρώπινο επιθήλιο των σιελογόνωναδένων. Τα οιστρογόνα φαίνεται ότι τροποποιούν τις αποκρίσεις του επιθηλίου τωνσιελογόνων αδένων στα φλεγμονώδη ερεθίσματα όπως υποδεικνύεται από τηναναστολή της επηγμένης από την ΙΦΝγ έκφρασης ICAM.1 από την 17β-οιστραδιόληκαι τους εκλεκτικούς αγωνιστές για τον ERα και τον ERβ. Η αποκρισιμότητα τωνκαλλιεργημένων ΕΚΣΑ που προέρχονται από ασθενείς με σS στα οιστρογόνα,βρέθηκε σημαντικά μειωμένη παρότι αυτό το φαινόμενο δε φάνηκε να συσχετίζεταιμε το πρότυπο πρωτεϊνικής έκφρασης ERα και ERβ. Στη βάση τωνανοσορυθμιστικών ιδιοτήτων των οιστρογόνων, η μειωμένη αποκρισιμότητα τωνΕΚΣΑ των ασθενών με σS στην 17β-οιστραδιόλη πιθανότατα να έχει άμεσησυνάφεια με την παθοφυσιολογία του συνδρόμου και να αντικατοπτρίζει τηδιαταραγμένη ανοσολογική λειτουργία των ΕΚΣΑ στο σS, αναπαριστώντας μίαλειτουργική εκδήλωση των συστασιακά ενεργοποιημένων κυτταρικών μηχανισμών οιοποίοι φαίνεται ότι λαμβάνουν χώρα στα επιθήλια στων ασθενών με σS.