Βιοχημική απομόνωση κυτταρικού αντιγόνου Scl-70 και ανάπτυξης ανοσοενζυματικής μεθόδου για κλινική εφαρμογή

Abstract

The antibodies to Scl-70 nuclear antigen (topoisomerase-I) are specifically encountered in 20-60% of patients with scleroderma. For the detection of the anti-Scl-70 antibodies immunoprecipitation methods in agarose gels (double immunodiffusion and counterimmunoelectrophoresis) against crude extracts of rabbit thymus are most often used. The purification of Scl-70 antigen would allow the quantitative detection of these autoantibodies by means of sensitive immunoassays, such as ELISA. In this study, we assessed the sensitivity and specificity of an ELISA method that we had developed for the detection of IgG anti-Scl70 antibodies using as reference method counterimmunoelectrophoresis (CIE). As antigen we used a purified Scl-70 protein (of 70 KDa molecular weight) that we prepared from rat liver nuclei by KCl extraction and cation exchange chromatography Bio-Rex 70. Similarly, the antigenic properties of a commercially available Scl-70 preparation (CELLON) purified by immunoaffinity chromatography were also examined. Screening included 46 anti-Scl-70 positive serum samples (by CIE, all from patients with scleroderma) and 138 anti-Scl-70 negative serum samples 39 from patients with scleroderma, 40 systemic lupus erythematosus, SLE, 39 rheumatoid arthritis, RA, and 20 healthy controls, HC). The analysis of the results (cut-off: mean + 3 standard deviations of HC) of our Scl-70 preparation indicated a sensitivity of 91% (42/46) and a specificity of 90% (100% in scleroderma, 85% in SLE, 80% in RA and 100% in HC). The commercial preparation showed a sensitivity of 81% (13/16) and a specificity of 79%? (85% in scleroderma, 67% in SLE, 76% in RA and 100% in HC). Our data indicate that the presence of non-Scl-70 antigenic substances contaminating Scl-70 preparations may variably influence the performance of ELISA methods for the detection of anti-Scl-70 antibodies.

Ένα σημαντικό ποσοστό, 20-60%, των ασθενών με σκληρόδερμα παρουσιάζουν στον ορό του αίματος τους αντισώματα κατά του πυρηνικού αντιγόνου Scl-70 (τοποισομεράση Ι). Τα αυτοαντισώματα αυτά που φαίνονται ότι χαρακτηρίζουν ειδικά το σκληρόδερμα, ανιχνεύονται συνήθως με τεχνικές ιζηματινοαντιδράσεων σε γέλη αγαρόζης όπως είναι η διπλή ανοσοδιάχυση και η αντίθετη ανοσοηλεκτροφόρηση. Στις ποιοτικές αυτές τεχνικές ως αντιγόνο χρησιμοποιούνται συνήθως αδρά ακετονικά εκχυλίσματα θύμου κουνελιού. Η ανάπτυξη ειδικών ανοσοενζυμικών μεθόδων (ELISA) θα επέτρεπε την ευαίσθητη και ποσοτική ανίχνευση αυτών των αντισωμάτων σε ασθενείς με σκληρόδερμα και θα συνέβαλε στην πρώιμη διάγνωση άλλων. Στην παρούσα μελέτη αναπτύξαμε μέθοδο ELISA για την ανίχνευση των IgG αντι-Scl-70 χρησιμοποιώντας ως αντιγόνο πρωτεΐνη Scl-70 που παρασκευάσαμε βιοχημικά από ηπατοκύτταρα αρουραίων μετά από εκχύλιση με KCl και κατιοντοανταλλακτική χρωματογραφία σε στήλη Bio-Rex 70. Παρόμοια, ερευνήσαμε τις αντιγονικές ιδιότητες ενός εμπορικά διατιθέμενου παρασκευάσματος Scl-70 (CELLON) που σύμφωνα με τον παρασκευαστή είχε απομονωθεί με χρωματογραφία ανοσοσυγγένειας και που προσφέρεται για εφαρμογή σε ELISA. Μελετήθηκαν 85 δείγματα ορού αίματος ασθενών με σκληρόδερμα, 40 ασθενών με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ), 39 ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) και 20 υγιών μαρτύρων. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων, που έγινε χρησιμοποιώντας ως μέθοδο αναφοράς την ανίχνευση των αντι-Scl-70 με την κλασσική τεχνική της αντίθετης ανοσοηλεκτροφόρησης, έδειξε ότι το βιοχημικά απομονωθέν Scl-70 παρουσίασε ευαισθησία 91% (42/46) και ειδικότητα 90% (100% στους ασθενείς με σκληρόδερμα, 85% στους ασθενείς με ΣΕΛ, 80% στους ασθενείς με ΡΑ και 100% στους υγιείς). Το εμπορικό παρασκεύασμα Scl-70 παρουσίασε ευαισθησία 81% (13/16) και ειδικότητα 79% (85% ασθενείς με σκληρόδερμα, 67% στους ασθενείς με ΣΕΛ, 76% στους ασθενείς με ΡΑ και 100% στους υγιείς). Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι η παρουσία αντιγονικών προσμείξεων στα παρασκευάσματα αντιγόνου Scl-70 είναι δυνατόν να επηρεάσει την ανίχνευση των αντι-Scl-70 με τις μεθόδους ELISA.