Συμβολή στη βιορρόφηση ραδιονουκλιδίων και βαρέων μετάλλων: ρόφηση νεοδυμίου, ουρανίου και καδμίου σε μικροοργανισμούς που ενυπάρχουν στα τρόφιμα

Abstract

It is well understood, that significant amounts of heavy metals or radionuclides in hydrosphere, may cause toxic effects and endanger human health. The last decades the scientific community investigates economical and environmental friendly methods to decontaminate the environment from such pollutants. For this aim, the use of microorganisms, has already been proposed as they can adsorb dissolved metal ions, especially in very low concentrations. The present thesis could be divided into three main parts (i) neodymium uptake by the yeasts Kluyveromyces marxianus, Debaromyces hansenii, Candida colliculosa, which are very similar to Saccharomyces cerevisiae. The last one has already been proposed as suitable biosorbent for many heavy metals. (ii) removal ability of U(VI) and Nd(III) by the bacterium Lactobacillus casei ΑΤCC 393 and (iii) uptake of uranium and neodymium ions by the yeast Saccharomyces bulardii. Neodymium and uranium were chosen as analogues of tri- and hexa-valent actinides respectively, which are very toxic and are generated from the various applications of nuclear energy. The microorganisms studied were selected as biosorbents, due to their low cost, as they exist in wastes of food industry. Furthermore, because of their ability to exist in human intestinal flora, a possible application of these microorganisms could be their use as potential checking agents, in case of invasion of radionuclides or heavy metals in the food chain. The main parameters, studied in all cases, were the effect of solution pH and the initial metal concentration. It was observed that, the metal uptake increased significantly by increasing the solution pH. Data of adsorption isotherm were fitted to Langmuir, Freundlich and Dubinnin-Radushkevich (D-R) models and were also analyzed according to Scatchard plots. In all cases, Scatchard plots revealed two types of binding sites or negative cooperation. In the first part, where a comparison between S. cerevisae and the three less studied microorganisms (K. marxianus, D. hansenii, C. colliculosa) was made, big differences were not observed. K. marxianus presented the higher neodymium capacity, which increased from 11 to 85 mg/g by varying the pH from 1.5 to 6. In the second part, the dependence of uranium uptake on the age of L. casei cells was studied by isothermal adsorption experiments, potentiometric titrations, microelectrophoretic measurements and proton or hydroxyl ion stoichiometry experiments. The exponential phase cells presented higher capacity, than stationary ones (180 and 140 mg/g respectively). For each type of cells, we quantified the effect of growth phase on the concentration of surface sites and on their deprotonation constants by performing potentiometric titration experiments. The concentration of each surface site and the corresponding pK value, decreased as the cells moved from exponential to stationary phase. With cells isolated from stationary phase, it was observed a stronger chemical interaction with uranium than neodymium ions. Microelectrophoretic measurements and proton or hydroxyl ion stoichiometry experiments for both metals, suggested that uranium is possibly bound by forming inner sphere complexes, while neodymium ions, are likely to be bound by forming hydrogen bonds with surface functional groups. In the third part, S. bulardii was isolated from a pharmaceutical product suitable for human consumption (Ultra Levure). The maximum uranium or neodymium uptake by this microorganism (qmax) was estimated 170 and 75 mg metal /g respectively. In order to determine the main biosorptive groups, chemical modification of the surface was attempted by various ways. The product of modification was characterized by FT-IR spectroscopy, microelectrophoretic measurements and potentiometric titrations. Biomass that had been modified by acetylation of hydroxyl, amine and phosphate groups, presented the minimum uptake for both metals. This clearly indicated that at least one of these groups should be one of the main binding sites.Finally, an adsorption model was developed for the binding mechanism of uranium and neodymium ions onto S. boulardii cells. The model describes the existing experimental data satisfactorily, indicating that phosphate groups are likely to be the main biosorptive groups of these two metals.

Η παρουσία βαρέων μετάλλων και ραδιονουκλιδίων σε σημαντικές ποσότητες στoν υδρoφόρο ορίζοντα, μπορεί να προκαλέσει τοξικά φαινόμενα και να θέσει σε κίνδυνο την ανθρώπινη υγεία. Τις τελευταίες δεκαετίες, η επιστημονική κοινότητα ερευνά οικονομικές και φιλικές προς το περιβάλλον μεθόδους απορρύπανσης από τέτοιου είδους ρύπους. Η χρήση των μικροοργανισμών για αυτό το σκοπό έχει ήδη προταθεί, καθώς μπορούν να δεσμεύουν διαλυμένα μεταλλικά ιόντα, ειδικά σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις.Η παρούσα διατριβή αποτελείται τρία μέρη που μελετούν: (i) δέσμευση του νεοδυμίου από τους ζυμομύκητες Kluyveromyces marxianus, Debaromyces hansenii, και Candida colliculosa, οι οποίοι είναι παρόμοιοι με τον Saccharomyces cerevisiae. Ο τελευταίος έχει ήδη προταθεί ως κατάλληλος βιορροφητής πολλών βαρέων μετάλλων. (ii) την ικανότητα απομάκρυνσης των U(VI) και Nd(III) από το βακτήριο Lactobacillus casei ΑΤCC 393 και (iii) την πρόσληψη ιόντων ουρανίου και νεοδυμίου από τον ζυμομύκητα Saccharomyces bulardii.Το νεοδύμιο και το ουράνιο επιλέχθηκαν ως ανάλογα των τρισθενών και εξασθενών ακτινίδων αντίστοιχα. Οι ακτινίδες είναι πολύ τοξικές και παράγονται από τις ποικίλες εφαρμογές της πυρηνικής ενέργειας. Οι μικροοργανισμοί που μελετήθηκαν επελέγησαν ως βιορροφητές, λόγω του χαμηλού κόστος απόκτησής τους, επειδή αφθονούν ως παραπροϊόντα της βιομηχανίας τροφίμων. Επιπλέον, λόγω της ικανότητας τους να επιβιώνουν στο ανθρώπινο εντερικό σύστημα, μια πιθανή εφαρμογή τους θα ήταν να χρησιμοποιηθούν ως μέσα ελέγχου σε περιπτώσεις μόλυνσης της τροφικής αλυσίδας από ραδιονουκλίδια ή βαρέα μέταλλα.Οι παράμετροι που μελετήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις ήταν η επίδραση του pH και της αρχικής συγκέντρωσης. Παρατηρήθηκε ότι αυξανομένου του pH αυξήθηκε η δέσμευση των μετάλλων. Πειραματικά δεδομένα των ισόθερμων προσρόφησης προσομοιώθηκαν με τα μοντέλα προσρόφησης Langmuir, Freundlich και Dubinnin-Radushkevich (D-R), ενώ επιπλέον αναλύθηκαν σύμφωνα με τα γραφήματα Scatchard. Αυτά σε όλες τις περιπτώσεις υπέδειξαν είτε την ύπαρξη δύο υποδοχέων δέσμευσης είτε αρνητικής συνέργιας.Στο πρώτο μέρος της μελέτης, όπου συγκρίθηκε η ρόφηση Nd(III) από τον S. cerevisiae με τρεις λιγότερο μελετημένους ζυμομύκητες (K. marxianus, D. hansenii, C. colliculosa) δεν παρατηρήθηκαν μεγάλες διαφορές. Ο K. marxianus παρουσίασε όμως την μεγαλύτερη δέσμευση, που αυξήθηκε από 11 σε 85 mg/g όταν το pH από 1,5 έγινε 6.Στο δεύτερο μέρος η εξάρτηση της πρόσληψης ουρανίου από την ηλικία των κυττάρων του βακτηρίου L. casei μελετήθηκε με ισόθερμες προσρόφησης, με ποτενσιομετρικές τιτλοδοτήσεις και πειράματα στοιχειομετρίας πρωτονίου/ υδροξειδίου – ιόντος. Τα κύτταρα της εκθετικής φάσης παρουσίασαν μεγαλύτερη χωρητικότητα συγκρινόμενα με αυτά της στατικής φάσης (qmax =180 και 140 mg/g αντίστοιχα). Για κάθε τύπο κυττάρων ποσοτικοποιήσαμε την επίδραση της φάσης ανάπτυξης με την συγκέντρωση των επιφανειακών ομάδων, μέσω πετενσιομετρικών τιτλοδοτήσεων. Παρατηρήθηκε ελάττωση της συγκέντρωσης και του αντιστοίχου pK της ομάδας με αύξηση της ηλικίας των κυττάρων. Σε κύτταρα της στατικής φάσης η δέσμευση του ουρανίου ήταν μεγαλύτερη από του νεοδυμίου. Μετρήσεις μικροηλεκτροφορητικής κινητικότητας και πειράματα στοιχειομετρίας πρωτονίου/ υδροξειδίου – ιόντος υποδεικνύουν ότι το ουράνιο πιθανά συνδέεται σχηματίζοντας σύμπλοκα εσωτερικής σφαίρας, ενώ τα ιόντα νεοδυμίου πιθανά συνδέονται μέσω δεσμών υδρογόνου. Στο τρίτο μέρος της διατριβής ο ζυμομύκητας S. bulardii απομονώθηκε από φαρμακευτικό προϊόν κατάλληλο για τον άνθρωπο (Ultra Levure). Η μέγιστη δέσμευση (qmax) U(VI) και Nd(III) από το ζυμομύκητα εκτιμήθηκε σε 180 και 75 mg μετάλλου /g αντίστοιχα. Με σκοπό να προσδιορίσουμε τις κύριες ομάδες δέσμευσης που διαθέτουν τα κύτταρα επιχειρήθηκε τροποποίηση της επιφάνειας. Το προϊόντα χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπία FT-IR, διαφορική ποτενσιομετρία και μικροηλεκτροφόριση. Την μικρότερη δέσμευση μετάλλου παρουσίασε η τροποποιημένη βιομάζα, στην οποία έγινε ακετυλίωση των υδροξυ-, αμινο- και φωσφονικών ομάδων. Αυτό δηλώνει ότι τουλάχιστον μια από αυτές τις τρεις ομάδες έχει σημαντική συνεισφορά στη δέσμευση του μετάλλου. Τέλος, αναπτύχθηκε ένα μοντέλο δέσμευσης των ιόντων του ουρανίου και νεοδυμίου από το ζυμομύκητα S. bulardii, σε φωσφονικές ομάδες. Το μοντέλο περιγράφει ικανοποιητικά τα πειραματικά μας αποτελέσματα, ενώ είναι σε συμφωνία με πειραματικά δεδομένα, που προβλέπουν ότι οι φωσφονικές ομάδες συνεισφέρουν σημαντικά στο φαινόμενο.