Μετάδοση σήματος (AtoS-AtoC/AZ) και η συμβολή του στην παραγωγή νανοβιοτεχνολογικών προϊόντων

Abstract

AtoSC two-component signal transductiom system in Escherichia coli constitutes sensor kinase AtoS and response regulator AtoC. AtoSC is induced by multiple inducers and is a key regulator of central bacterial mechanisms including the regulation of atoDAEB operon, chemotaxis, motility, adaptation, poly-(R)-3-hydroxybutyrate (cPHB) biosynthesis and mechanisms affecting antibiotics resistance. During the present Ph.D. Thesis, the AtoSC signaling mechanism was further elucidated, through studies of additional interactions between its constituents and the regulatory roles of AtoC N-terminal domain with its inducers, for the regulation of atoDAEB operon and cPHB biosynthesis. New AtoSC inducers were identified sensed during the signal transduction. Three inhibitors of AtoSC signaling (Closantel, RWJ-49815 and TNP-ATP) were indentified. They inhibit AtoS autophosphorylation and AtoS to AtoC phopshotransfer. The consequences of this inhibition on AtoSC-regulated physiological processes, establish AtoSC as a target for antibacterial agents. AtoSC up-regulates the biosynthesis and accumulation of storage polyhydroxyalkanoates, ΡΗΒ and P(3HB-co-3HV), in recombinant phaCAB+ E. coli, expressing the PhaCAB enzymes from Alcaligens eutrophus. The acetoacetate-induced AtoSC optimizes the biopolymers production quantitatively and qualitatively, and enhances the HV incorporation in the copolymer P(3HB-co-3HV). AtoSC regulates cPHB and biopolymers biosynthesis through atoDAEB operon and additional processes, attributed to its constituents separately, with AtoC being the most effective. Interplay between β-oxidation and fatty acid biosynthesis including AtoSC participation regulates cPHB in E. coli and polyhydroxyalkanoate biosynthesis in recombinant phaCAB+ E. coli.

Το σύστημα μετάδοσης σήματος δύο συστατικών AtoSC της Escherichia coli αποτελείται από την αισθητήρια κινάση AtoS και το ρυθμιστή απόκρισης AtoC. Το AtoSC επάγεται από πλήθος επαγωγέων και είναι ρυθμιστής κλειδί για τον έλεγχο καίριων βακτηριακών διαδικασιών όπως η ρύθμιση του οπερονίου atoDAEB, η χημειόταξη, η κινητικότητα, η προσαρμογή, η βιοσύνθεση του πολυ-(R)-3-υδροξυβουτυρικού οξέος (cPHB) και διαδικασίες αντίστασης σε αντιβιοτικά. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, διευκρινίσθηκε περαιτέρω ο μηχανισμός μετάδοσης σήματος από το AtoSC, μέσω της μελέτης των επιπρόσθετων αλληλεπιδράσεων των συστατικών του και των ρυθμιστικών ρόλων της Ν-τελικής ρυθμιστικής περιοχής του AtoC με τους επαγωγείς του, προς τη ρύθμιση του οπερονίου atoDAEB και τη βιοσύνθεση του cPHB καθώς και με την ταυτοποίηση επιπρόσθετων σημάτων επαγωγής που αναγνωρίζονται κατά τη διαδικασία μετάδοσης του σήματος. Ταυτοποιήθηκαν τρεις παρεμποδιστές της μετάδοσης σήματος μέσω του AtoSC (Closantel, RWJ-49815 και TNP-ATP). Παρεμποδίζουν την αυτοφωσφορυλίωση της κινάσης AtoS και τη φωσφομεταφορά από την AtoS στο AtoC. Οι συνέπειες αυτής της παρεμπόδισης στις AtoSC-ελεγχόμενες φυσιολογικές διαδικασίες, εγκαθιδρύουν το σύστημα ως στόχο προς το σχεδιασμό αντιβακτηριακών παραγόντων. Το AtoSC ρυθμίζει θετικά τη βιοσύνθεση και τη συσσώρευση των αποθηκευτικών πολυϋδροξαλκανοϊκών οξέων, ΡΗΒ και P(3HB-co-3HV), σε ανασυνδυασμένα phaCAB+ E. coli, που εκφράζουν εξωχρωμοσωμικά τα ένζυμα PhaCAB από τα Alcaligens eutrophus. To επαγώμενο-ακετοξικού AtoSC βελτιστοποιεί την παραγωγή των βιοπολυμερών ποσοτικά και ποιοτικά και αυξάνει την ενσωμάτωση του μονομερούς HV στο συμπολυμερές P(3HB-co-3HV). Το AtoSC ρυθμίζει τη βιοσύνθεση του cPHB και των βιοπολυμερών, μέσω του οπερονίου atoDAEB αλλά και μέσω επιπρόσθετων διαδικασιών, ένας μηχανισμός που αποδίδεται στα συστατικά του ξεχωριστά με αποδοτικότερο το AtoC. Δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ της β-οξείδωσης και της βιοσύνθεσης των λιπαρών οξέων στο οποίο συμμετέχει το AtoSC ρυθμίζει τη βιοσύνθεση του cPHB στην E. coli και των πολυϋδροξυαλκανοϊκών οξέων σε ανασυνδυασμένα phaCAB+ E. coli.