Μελέτη της παθογένειας, ευπάθειας και παθολογίας του ιού Noda σε ευρύαλα είδη ψαριών εκτρεφόμενα υπό διαφορετικές συνθήκες αλατότητας.

Abstract

Nodaviruses that affect fish species belong to the family Nodaviridae and the genus Betanodavirus (Carstens et al., 2000). The description of the morphology of the first Betanodavirus that was isolated from fish and its identification as the aetiological factor of viral encephalopathy and retinopathy was made by Yoshikoshi & Inoue (1990). The particle of the virus is round with a diameter of 25-34 nm and is consisted by the capsid and the genome.Fish Νodaviruses are categorised into four genotypes, according to the phylogenetic analysis that was based on the sequencing of the nucleotides of the Τ4 region of the RNA2 genomic part. From the Mediterranean fish until today, two genotypes have been isolated, RGNNV and BFNNV (Thiery et al., 2004) with the first being more frequent.Viral encephalopathy and retinopathy (VER) is a very important disease of larvae and juvenile fish. In these stages, fish are more sensitive to the virus and the losses are greater than in older fish. Generally, the clinical signs are caused by the lesions of the brain and the retina, thus developing kinetic dysfunctions, loss of the control of the swim bladder, difficulties in the vision and dark colouring of the skin.In Greece the disease was first reported in 1995 in the beginning of July (Le Breton et al., 1997) in sea bass. Since then the disease has been reported by other scientists due to the fact that it causes great losses in the fish farms every year.The present thesis concerns the study of the pathogenesis, pathology and susceptibility of different euryhaline fish species to Noda virus, raised under different salinity conditions.The thesis is divided into two Parts. In the first Part the literature is described and in the second Part there are three Chapters, Material & Methods, Results and Discussion.10In the first part the relevant literature is reviewed and this part is divided into three chapters. In chapter A, the world, european and greek aquaculture situation is described. In chapter B, the taxonomy, the morphology and the structure of the virus is described, as well as the physicochemical properties, the phylogenetic relevance between the species of the family Nodavirinae. In chapter C, the literature of the disease that the virus causes, is reviewed. In this chapter the pathogenesis, the clinical signs, the pathological findings, the epizootiology, the diagnosis and the preventions of the disease, are described, as well as the experimental transmissions of the virus in fish in the existing literature.In the second Part, in the chapter Material and Methods, the protocol used in each experiment and the laboratory techniques used for the detection of the virus are described. The statistical packages used for the statistical analysis of the results are also described.In the Results, the findings of the clinical signs of the two experiments are discussed. It was found that sea bass raised in fresh water developed more severe clinical signs and the total mortality of the fish was greater than that of the sea bass raised in the other two salinities. Moreover in this chapter, the results of real-time PCR are described and the titer of the virus in the eyes of the fish is calculated according to the day after the inoculation of the virus. The results of the cell culture inoculation are described according to which some positive samples to real-time PCR, were found negative to cell culture. Also in this chapter, the sequencing of the genome of the virus after its isolation from the fish of the two experiments is described, as well as the pathological findings and the lesions that the virus caused in the fish tissues according to the day after the inoculation of the virus.From the findings of the present study the following conclusions can be drawn:11 Although the titer of the virus in sea bass raised in fresh water was lower than that of sea bass raised in the other two salinities, the mortality of the fish was greater. The greater percentage of mortality that was observed in the sea bass that were moved to fresh water is due to the decreased ability of the immunity system of these fish against the virus. This could be caused by the osmotic stress that fish undergo trying to adapt to fresh water. The lesions caused to the nervous system and especially the pituitary, by the virus, can have caused dysfunction in the harmonic balance which would disturb the osmoregulation and made the fish more vulnerable to pathogens such as Noda virus. Real-time PCR proved to be a very reliable and sensitive method for the qualitative and quantitative identification of the virus in fish tissues. It gives us the benefit to correlate the clinical signs, the pathological findings and the mortality, with the development of the titer of the virus in the fish tissues. Sea bream did not develop clinical signs with neither of the two doses of the virus inoculated. The transmission of the virus to sea bream was confirmed by real-time PCR and the titer of the virus in the eyes of sea bream were lower than that of sea bass, although the doses inoculated in sea bass were the same or lower. The titer of the virus in sea bream evolved in the same way as in sea bass concerning time. The virus was transmitted to healthy sea bass by eating the eyes of the asymptomatic sea bream of the first experiment.

Οι Noda-ιοί που προσβάλλουν τα ψάρια (κλάση οστεοϊχθείς) ανήκουν στην οικογένεια Nodaviridae και στο γένος Betanodavirus (Carstens και συν., 2000). Η περιγραφή της μορφολογίας του πρώτου Betanoda-ιού που απομονώθηκε από ψάρια και η ταυτοποίησή του ως αιτιολογικού παράγοντα της νόσου της ιογενούς εγκεφαλοπάθειας και αμφιβληστροειδοπάθειας (VER) έγινε από τους Yoshikoshi & Inoue (1990). Το σωματίδιο των Betanoda-ιών είναι σφαιρικό, με διάμετρο 25-34 nm και αποτελείται από το καψίδιο και το γένωμα.Οι Νoda-ιοί των ψαριών έχουν κατηγοριοποιηθεί σε τέσσερις γενότυπους, σύμφωνα με φυλογενετική ανάλυση που βασίστηκε στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων της μεταβλητής περιοχής (Τ4 περιοχή) του RNA2 γενωμικού τμήματος. Στα ψάρια της Μεσογείου έχουν απομονωθεί μέχρι σήμερα δύο από τους γενότυπους αυτούς, ο RGNNV και ο BFNNV (Thiery και συν., 2004) με πιο συχνό τον πρώτο.Η ιογενής εγκεφαλοπάθεια και αμφιβληστροειδοπάθεια είναι μία σημαντική νόσος των λαρβών, αλλά και ψαριών μεγαλύτερου μεγέθους. Τα περισσότερα ψάρια προσβάλλονται στο στάδιο της προνύμφης ή σε νεαρά στάδια ανάπτυξης, οπότε οι απώλειες είναι συνήθως πολύ μεγάλες. Γενικά, τα κλινικά συμπτώματα συσχετίζονται με τις αλλοιώσεις στον εγκέφαλο και τον αμφιβληστροειδή, δηλαδή παρατηρούνται κινητικές ανωμαλίες, απώλεια ελέγχου της νηκτικής κύστης, δυσκολία στην όραση και σκούρος χρωματισμός του δέρματος.Η νόσος παρατηρήθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα στις αρχές του Ιουλίου του 1995 (Le Breton και συν., 1997) στο λαβράκι. Έκτοτε έχει αναφερθεί και από άλλους έλληνες ερευνητές αφού αποτελεί μια σημαντική νόσο που προκαλεί κάθε χρόνο μεγάλες απώλειες στις ελληνικές ιχθυοκαλλιέργειες.Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη μελέτη της παθογένειας, της ευπάθειας και της παθολογίας του Noda-ιού σε ευρύαλα είδη ψαριών εκτρεφόμενα υπό διαφορετικές συνθήκες αλατότητας.Η διατριβή χωρίζεται σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος περιέχει τη βιβλιογραφική ανασκόπηση και το δεύτερο μέρος αφορά στη δική μας έρευνα και απαρτίζεται από τρία κεφάλαια τα: ‘’Υλικά και Μέθοδοι’’, ‘’Αποτελέσματα’’ και ‘’Συζήτηση’’.Στο πρώτο μέρος γίνεται ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας και διαιρείται σε τρία κεφάλαια. Στο πρώτο κεφάλαιο περιγράφεται η κατάσταση των υδατοκαλλιεργειών σε παγκόσμιο, ευρωπαϊκό και ελληνικό επίπεδο. Στο δεύτερο περιγράφεται η ταξινόμηση, η μορφολογία, η δομή και η σύσταση του ιού καθώς και οι φυσικοχημικές ιδιότητές του, η φυλογενετική συγγένεια μεταξύ των ειδών της οικογένειας Nodavirinae και η ορολογική συγγένεια των γενοτύπων των Betanoda-ιών. Στο τρίτο κεφάλαιο γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση της νόσου της ιογενούς εγκεφαλοπάθειας και αμφιβληστροειδοπάθειας. Ειδικότερα περιγράφεται η παθογένεια της νόσου, τα κλινικά συμπτώματα, οι παθολογοανατομικές αλλοιώσεις που παρατηρούνται, η επιζωοτιολογία, οι τρόποι διάγνωσης και πρόληψης του ιού και τέλος περιγράφονται οι μέθοδοι πειραματικής μόλυνσης ψαριών με Noda-ιούς που υπάρχουν μέχρι σήμερα στη διεθνή βιβλιογραφία.Στο δεύτερο μέρος στο κεφάλαιο ‘’Υλικά και Μέθοδοι’’, περιγράφεται το πειραματικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση ενός προκαταρκτικού και δύο κυρίως πειραμάτων, τα υλικά και οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση του ιού και τα στατιστικά πακέτα που χρησιμοποιήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Στο κεφάλαιο ‘’Αποτελέσματα’’ περιγράφονται τα ευρήματα της κλινικής εξέτασης των ψαριών των δύο πειραμάτων κατά την οποία στο πρώτο πείραμα διαπιστώθηκε ότι τα λαβράκια που εκτρέφονταν σε γλυκό νερό εκδήλωσαν πιο έντονα συμπτώματα και υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας, σε σχέση με τα λαβράκια που εκτρέφονταν σε ενυδρεία με νερό ενδιάμεσης ή πλήρους αλατότητας. Επίσης παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time PCR), με την οποία έγινε η τιτλοποίηση του ιού στους οφθαλμούς των ψαριών όλων των ενυδρείων, καθώς και η συσχέτιση των τίτλων του ιού με τις ημέρες μετά από τον ενοφθαλμισμό των ψαριών. Ακόμα, αναφέρονται τα αποτελέσματα της απομόνωσης του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες κατά την οποία διαπιστώθηκε ότι δείγματα αρνητικά με τη μέθοδο αυτή, ήταν θετικά όταν ελέγχθηκαν με τη μέθοδο της real-time PCR. Επιπλέον περιγράφεται η ανάλυση πρωτοδιάταξης των γενωμάτων του ιού που απομονώθηκαν από τους οφθαλμούς των ψαριών και τέλος, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της ιστοπαθολογικής μελέτης του πρώτου και δευτέρου πειράματος σε συνάρτηση με τις ημέρες μετά την έναρξη των πειραμάτων.Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής συνοψίζονται στα εξής: Παρό,τι τα λαβράκια στο ενυδρείο του γλυκού νερού είχαν μικρότερους τίτλους ιού από τα λαβράκια στα ενυδρεία με ενδιάμεση ή πλήρη αλατότητα, οι θνησιμότητες στα ψάρια αυτά ήταν μεγαλύτερες. Το μεγαλύτερο ποσοστό θνησιμότητας που παρατηρήθηκε στα λαβράκια του γλυκού νερού είναι πιθανό να οφείλεται στην μειωμένη ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος των ψαριών αυτών να αντιμετωπίσει τον ιό. Η διαταραχή αυτή προκλήθηκε από το οσμωτικό στρες στο οποίο υποβάλλονται τα ψάρια όταν μεταφέρονται στο γλυκό νερό. Η προσβολή του ΚΝΣ και ιδιαίτερα της υπόφυσης από τον ίδιο τον ιό, είναι πιθανό να οδήγησε στη διαταραχή της ομοιοστασίας του οργανισμού των ψαριών σε επίπεδο ορμονών. Αποτέλεσμα της ορμονικής διαταραχής ήταν η πρόκληση προβλημάτων στην οσμωρύθμιση των ψαριών. Τα ψάρια αυτά ήταν πιο επιρρεπή σε οποιαδήποτε παθολογική κατάσταση και κατ΄ επέκταση στη μόλυνση από το Noda-ιό. Πρέπει να δοθεί μεγάλη σημασία στην αποφυγή των στρεσσικών καταστάσεων σε διαχειριστικό επίπεδο στις μονάδες διότι η σημασία της πρόκλησης στρες κατά τη διάρκεια της μόλυνσης με τον Noda- ιό αποδείχθηκε κατά την παρούσα διατριβή. Η μέθοδος της real-time PCR είναι μια πολύ αξιόπιστη και ευαίσθητη μέθοδος με την οποία επιτυγχάνεται ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του ιού στους ιστούς των ψαριών. Δίνει τη δυνατότητα να συσχετισθούν τα συμπτώματα, η παθολογοανατομική εικόνα και οι θνησιμότητες στα ψάρια με την εξέλιξη των τίτλων του ιού κατά τη διάρκεια της νόσου, σε συντομότερο χρονικό διάστημα απ΄ ότι η κλασική μέθοδος απομόνωσης του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες. Στα λαβράκια του πρώτου πειράματος παρατηρήθηκε αντιστοιχία μεταξύ της ημέρας που παρατηρήθηκαν οι υψηλότεροι τίτλοι του ιού στους ιστούς τους και της ημέρας που παρατηρήθηκε το μεγαλύτερο ποσοστό συμπτωμάτων. Οι τσιπούρες στο πρώτο πείραμα δεν εκδήλωσαν συμπτώματα μετά από μόλυνση με δύο διαφορετικές δόσεις του ιού. Η μόλυνση επιβεβαιώθηκε με τη μέθοδο της real-time PCR και οι τίτλοι του ιού στους οφθαλμούς τους ήταν μικρότεροι από εκείνους του λαβρακιού παρό,τι η μολύνουσα δόση στις τσιπούρες ήταν ίδια και μεγαλύτερη από αυτή στα λαβράκια. Οι τίτλοι του ιού στις τσιπούρες είχαν την ίδια εξέλιξη από απόψεως χρόνου όπως και εκείνοι των λαβρακιών. Ο ιός μεταδόθηκε σε υγιή λαβράκια μετά από βρώση οφθαλμών των ασυμπτωματικά μολυσμένων τσιπούρων του πρώτου πειράματος.