Μελέτη των ιστολογικών και βιοχημικών αλλοιώσεων του φλεβικού τοιχώματος στη φλεβική αναστόμωση των συνθετικών αρτηριοφλεβικών μοσχευμάτων

Abstract

The aim of the current PhD thesis was the study of histological and biochemical changes of venous wall in the venous anastomosis of synthetic arteriovenous grafts, during the development of intimal hyperplasia and consequent obstruction of grafts. For this purpose, we studied the temporal and topographic expression of major factors which actively participate in the pathophysiologic mechanisms of intimal hyperplasia. 24 healthy male Large White×Landrace pigs (95±3 kg) underwent surgical exposure of the right common carotid artery and right jugular vein, and creation of arteriovenous shunt via an ePTFE graft. The animals were randomly allocated into three groups and sacrificed after two, four and twelve weeks postoperatively. After euthanasia, the shunted and contralateral jugular and carotid of the animal models were excised, taking high care to avoid damage to vessel walls. Tissues were then divided in 3 parts of equal size, based on topographic localisation (proximal, central and distal range of the arteriovenous shunt). Histomorphometric analysis of intimal hyperplasia and changes of vessel wall were conducted using hematoxylin-eosin staining. The vessel wall network of elastic and collagen fibres became visible after orcein and picro-Sirius Red staining, respectively. In the wall of venous anastomosis, we detected immunohistochemically and analysed the expression of alpha-actin and desmin of smooth muscle cells, cell proliferation marker ki-67, macrophage cell surface marker CD68, von Willebrand factor of endothelial cells and laminin. After the isolation of total RNA from jugular vein tissue and synthesis of cDNA, mRNA expression of VEGFA, NOS3, EDN1, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2, ICAM1, VCAM1, FGF2, COL1A1 and COL3A1 genes was studied, with the use of conventional RT-PCR. A highly sensitive quantitative real time PCR method was also developed for the quantification of mRNA expression levels of the above-mentioned genes. In conclusion, the creation of arteriovenous shunt via an ePTFE graft induces extensive vascular remodeling, cell migration and proliferation, neovascularisation, degradation of extracellular matrix, endothelial damage, fibrosis, and development of intimal hyperplasia with unfavourable consequences in the graft patency and functionality. Histological and biochemical changes to venous wall in the venous anastomosis of synthetic arteriovenous grafts occur in all three topographic regions in the vicinity of the anastomosis, during 12 weeks after placing the grafts. These changes are more profound in the central region, less remarkable in the proximal region, and even less notable in the distal region of the venous anastomosis, and they become more profound in the time course.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση των ιστολογικών και βιοχημικών αλλοιώσεων στη φλεβική αναστόμωση των συνθετικών αρτηριοφλεβικών μοσχευμάτων, κατά την ανάπτυξη ινομυϊκής υπερπλασίας και της επακόλουθης απόφραξης των μοσχευμάτων. Σε 24 υγιείς αρσενικούς χοίρους Large White×Landrace (95±3 kg) δημιουργήθηκε αρτηριοφλεβική επικοινωνία μεταξύ της κοινής καρωτίδας και της έσω σφαγίτιδας με χρήση μοσχεύματος ePTFE. Τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ισάριθμες πειραματικές ομάδες και ευθανατώθηκαν τη 2η, 4η και 12η εβδομάδα ακολούθως της χειρουργικής επέμβασης. Κατά την ευθανασία, αφαιρέθηκαν η αναστομωμένη και η ετερόπλευρη (στο ίδιο ύψος) σφαγίτιδα και καρωτίδα των ζωικών προτύπων. Κατόπιν, οι ιστοί διαιρέθηκαν σε 3 ισομεγέθη τμήματα βάσει της τοπογραφικής τους εντόπισης (εγγύς, κέντρο και άπω περιοχή της αρτηριοφλεβικής επικοινωνίας). Πραγματοποιήθηκε ιστομορφομετρική ανάλυση της ινομυϊκής υπερπλασίας και των αλλοιώσεων του αγγειακού τοιχώματος με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης. Η ανάδειξη των ελαστικών και κολλαγόνων ινών έγινε με χρώση ορσεΐνης και Sirius Red, αντίστοιχα. Ακολούθησε στο τοίχωμα της φλεβικής αναστόμωσης ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης της α-ακτίνης και της δεσμίνης των λείων μυϊκών κυττάρων, του δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού ki-67, του δείκτη μακροφάγων CD68, του παράγοντα von Willebrand των ενδοθηλιακών κυττάρων και της λαμινίνης. Κατόπιν απομόνωσης ολικού RNA από τον ιστό της σφαγίτιδας και σύνθεσης cDNA, μελετήθηκε η έκφραση mRNA των γονιδίων VEGFA, NOS3, EDN1, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2, ICAM1, VCAM1, FGF2, COL1A1 και COL3A1 με τη μέθοδο της συμβατικής RT-PCR και της ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR). Συμπερασματικά, η δημιουργία αρτηριοφλεβικής επικοινωνίας με χρήση συνθετικού μοσχεύματος επάγει εκτεταμένη αγγειακή ανακατασκευή, μετανάστευση και πολλαπλασιασμό κυττάρων, νεοαγγείωση, αποδόμηση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, βλάβη του ενδοθηλίου, ίνωση και ανάπτυξη ινομυϊκής υπερπλασίας με δυσμενείς επιπτώσεις στη βατότητα και λειτουργικότητα του μοσχεύματος. Οι ιστολογικές και βιοχημικές αλλοιώσεις του τοιχώματος στη φλεβική αναστόμωση των συνθετικών αρτηριοφλεβικών μοσχευμάτων λαμβάνουν χώρα καθ’ όλη τη διάρκεια των 12 εβδομάδων μετά την τοποθέτηση του μοσχεύματος, ενώ εντοπίζονται πιο έντονες στην κεντρική περιοχή, αρκετά έντονες στην εγγύς περιοχή, και λιγότερο έντονες στην άπω περιοχή. Οι προκείμενες αλλοιώσεις αυξάνονται με την πάροδο του χρόνου.