Φθορισμομετρική μέθοδος προσδιορισμού ενεργότητας φωσφολίπασης Α2 (PLA2) με χρήση ακινητοποιημένων υποστρωμάτων

Abstract

Phospholipases A2 (PLA2s) are a family of highly regulated enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond of phospholipids, liberating free fatty acids and lyso-phospholipids. They are considered to be inflammation markers and their determination could give important information. In this framework, the purpose of the present study was the development and evaluation of a fluorimetric assay for the determination of PLA2 activity in biological samples. For this purpose C12- and C6-NBD-PC substrates were immobilized by entrapment in a polymer matrix. Excitation and emission spectra were recorded in a proper spectrofluorimeter, equipped with an ELISA plate. The fluorescence of the immobilized substrates was tested under various experimental conditions such as temperature, pH values, or Ca2+ concentrations. Furthermore, the behaviour of the immobilized substrates in proper buffer solutions was evaluated. It was also tested if they are desorbed in the aqueous phase with fluorescence and HPLC techniques. It was found that when PLA2 from biological samples acts on the immobilized substrate of C12-NBD-PC, C12-NBD-FA is yielding in the aqueous phase. Moreover, under these conditions, no desorption of the immobilized substrate took place. The fluorescence of the PLA2 reaction product is distinct from the fluorescence of the immobilized substrate. This result was confirmed: 1) fluorometrically, 2) in an HPLC unit and 3) with Thin Layer Chromatography (TLC). PLA2 activity was determined fluorometrically from the slope of the fluorescence enhancement in response to reaction time. Internal standard solution of C12-NBD-FA was also added in the reaction mixture. The method was evaluated under high protein concentrations, various incubation temperatures, pH values, Ca2+ concentrations and in the presence of PLA2 inhibitors. Furthermore, the present assay was validated by a fluorimetric and an HPLCfluorimetric method. Conclusively, the present assay is characterized by low limit detection (1pmol FA), is repeatable (%RSD ≤ 6%), reproducible (%RSD ≤ 9%) and could be applied in various experimental conditions. Additionally, has significant statistical correlation and good agreement with the methods which was evaluated. Finally, it introduces the use of immobilized substrates.

Οι Φωσφολιπάσες A2 (PLA2s) είναι ένζυμα που καταλύουν τον καταβολισμό των μεμβρανικών φωσφολιπιδίων απελευθερώνοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα και λύσο- φωσφολιπίδια. Θεωρούνται δείκτες φλεγμονής και για το λόγο αυτό παρουσιάζουν ιδιαίτερο κλινικό ενδιαφέρον. Προς την κατεύθυνση αυτή, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη και αξιολόγηση φθορισμομετρικής μεθόδου προσδιορισμού ενεργότητας PLA2 βιολογικών δειγμάτων. Για το σκοπό αυτό ακινητοποιήθηκαν με παγίδευση σε πήγμα πολυμερούς τα φθορίζοντα υποστρώματα της C12- και C6-NBD-PC. Εν συνεχεία, λήφθηκαν τα φάσματα διέγερσης και εκπομπής των ακινητοποιημένων υποστρωμάτων σε κατάλληλο φασματοφθορισμόμετρο, εφοδιασμένο με πλάκα ELISA. Εξετάσθηκαν διάφοροι παράμετροι, οι οποίοι δύναται να επηρεάσουν το φθορισμό της ακινητοποιημένης C12- και C6-NBD-PC, όπως θερμοκρασία, pH, ιόντα Ca2+. Μελετήθηκε η συμπεριφορά των ακινητοποιημένων υποστρωμάτων σε κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα και εξετάσθηκε εάν εκροφούνται στην υδατική φάση, τόσο φθορισμομετρικά, όσο και με τη βοήθεια διάταξης υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC). Εξετάσθηκε ακόμη η παρουσία πηγής πρωτεΐνης στο φθορισμό των ακινητοποιημένων C12- και C6-NBD-PC. Βρέθηκε πως όταν πηγή PLA2 δράσει στο ακινητοποιημένο υπόστρωμα της C12- NBD-PC απελευθερώνεται στην υδατική φάση C12-NBD-FA, ενώ δεν λαμβάνει χώρα εκρόφηση του ακινητοποιημένου υποστρώματος. Στις συνθήκες ανάλυσης ο φθορισμός του προϊόντος αντίδρασης της PLA2 είναι διακριτός από τον φθορισμό του ακινητοποιημένου υποστρώματος Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε: 1) φθορισμομετρικά, 2) με τη βοήθεια διάταξης HPLC και 3) με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC). Έτσι, η PLA2 προσδιορίστηκε φθορισμομετρικά από την κλίση της καμπύλης αύξησης της έντασης του φθορισμού του μίγματος αντίδρασης σε συνάρτηση με το χρόνο. Τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν με τη προσθήκη εσωτερικού προτύπου διαλύματος C12-NBD-FA στο μείγμα της αντίδρασης. Μελετήθηκε επίσης, η επίδραση της θερμοκρασίας, του pH, των ιόντων Ca2+, της παρουσίας ειδικών αναστολέων της PLA2 στον φθορισμομετρικό προσδιορισμό αυτής. Η μέθοδος συγκρίθηκε στατιστικά με φθορισμομετρική και με HPLC- φθορισμομετρική μέθοδο της βιβλιογραφίας. Συμπερασματικά, η παρούσα μέθοδος χαρακτηρίζεται από χαμηλό όριο ανίχνευσης (1pmol FA), ικανοποιητική επαναληψιμότητα (%RSD ≤ 6%), αναπαραγωγιμότητα (%RSD ≤ 9%), μπορεί να εφαρμοσθεί σε διάφορες πειραματικές συνθήκες και παρουσιάζει σημαντική στατιστική συσχέτιση με τις μεθόδους με τις οποίες συγκρίθηκε. Επιπλέον, εισάγει τη χρήση του ακινητοποιημένου υποστρώματος.