Μελέτη αυτοάνοσων και αλλοάνοσων επαναλαμβανόμενων αυτόματων αποβολών

Abstract

Recurrent spontaneous abortions (RSA) of immune etiology consist in our days the majority of RSA of unknown etiology. It has been proposed that they are largely associated with impaired local or systemic maternal immune response and are classified into autoimmune and alloimmune type depending on the mechanisms involved. However, despite the wide range of extensive research, there is no clear picture regarding the specific pathogenetic mechanisms of fetal loss in most cases. The aim of this study was to assess the immunological parameters presented to be important in the pathogenesis of unexplained RSA.Material and methods: The study group included 63 RSA couples (RSA defined as two or more consecutive pregnancy losses prior to 20 weeks of gestation), of reproductive age and Greek origin, in which other causes of miscarriage had been excluded. The control group consisted of 30 fertile couples, with at least two uncomplicated pregnancies at term and no history of abortion. The couples’ evaluation included: a) typing of HLA class I and II antigens/alleles using serological (CDC) and molecular (PCR-SSP,-SSOP) techniques b) detection of antipaternal lymphocytotoxic antibodies and panel reactive antibodies using CDC c) analysis of peripheral blood lymphocyte subpopulations and determination of NK receptors by flow cytometry using direct whole blood immunofluorescence d) expression of peripheral blood T lymphocytes intracellular Th1 (IFNγ, IL2) and Th2 (IL4, IL10) cytokines, after in vitro stimulation with mitogen, using flow cytometry. e) determination of autoantibodies (antinuclear and anti-dsDNA antibodies using indirect immunofluorescence and anti extractable nuclear antigens, antithyroid and antiphospholipid antibodies - anticardiolipin, anti b2 glycoprotein I and antiphosphatidylserine antibodies – using ELISA) e) lastly detection of lupus anticoagulant using Diluted Lussell’s viper venom time method.Results: a) the distribution and sharing of HLA antigens in couples with RSA was similar to that of control group b) no differences in antipaternal and panel reactive antibodies were observed c) a significant increase was found in the group of women with RSA in comparison to the control group concerning the percentages of NK cells (p=0.003), NK subpopulations (CD3-CD56+, p=0.003 and CD3-CD16-CD56+, p<0.0001) and TCRγδ+ T lymphocytes (p=0.007). d) regarding NKRs repertoire, expression of inhibitory receptors KIR2DL1 (CD158a) and KIR2DL2/3 (CD158b) were significantly decreased in women with RSA when compared with their partners (p=0.012 και p=0.014, respectively). e) no statistically significant differences were found on the cytokine expression profile of the women with RSA and the control group. f) the RSA group had a significantly higher insidence of antithyroid antibodies (p=0.04). An increased incidence of antiphospholipids antibodies considering the whole spectrum of them (p=0.02) was detected in RSA women, that lost its significance when specific antibodies evaluated separately. Conclusions: Complex immunological mechanisms are involved in the pathogenesis of RSA. Study of immunological parameters is considered as purposive, as these could be used as prognostic markers and could help in more precise theurapeutic strategies planning. Further research is needed for the development of new diagnostic approaches and effective treatment protocols.

Οι επαναλαμβανόμενες αυτόματες αποβολές (ΕΑΑ) ανοσολογικής αιτιολογίας αποτελούν σήμερα το μεγαλύτερο ποσοστό των μέχρι πρότινος αδιευκρίνιστων ΕΑΑ. Έχουν συσχετιστεί με διαταραχή της μητρικής ανοσιακής απάντησης είτε σε τοπικό είτε σε συστηματικό επίπεδο και διακρίνονται σε αυτοανόσου και αλλοανόσου τύπου ανάλογα με τους εμπλεκόμενους μηχανισμούς. Ωστόσο, παρά τη μακρά διάρκεια επισταμένων ερευνών, για ένα ποσοστό απώλειας εμβρύου τα ακριβή αίτια παραμένουν αδιευκρίνιστα. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη ανοσολογικών παραμέτρων που πιθανολογούνται ως σημαντικές στους παθογενετικούς μηχανισμούς των ΕΑΑ αγνώστου αιτιολογίας.Υλικό-Μέθοδοι: Η ομάδα μελέτης περιελάμβανε 63 ζευγάρια αναπαραγωγικής ηλικίας, Ελληνικής καταγωγής, με πρόβλημα ΕΑΑ (≥ 2 διαδοχικές αυτόματες αποβολές με ηλικία κυήματος μικρότερη των 20 εβδομάδων), στα οποία είχαν αποκλειστεί άλλα αίτια αποβολών. Την ομάδα σύγκρισης αποτέλεσαν 30 ζευγάρια, γονείς δύο τουλάχιστον τέκνων, με φυσιολογικό μαιευτικό και γυναικολογικό ιστορικό. Ο έλεγχος περιελάμβανε α) Τυποποίηση των HLA τάξης Ι (-Α, -Β, -C) και ΙΙ (-DR, -DQ) αντιγόνων/αλληλίων του ζεύγους με τη χρήση ορολογικών τεχνικών (μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας-CDC) ή/και τεχνικών μοριακής βιολογίας (PCR-SSP,-SSOP). β) Αναζήτηση με CDC τεχνική λεμφοκυτταροτοξικών αντισωμάτων στους ορούς των γυναικών, τόσο έναντι των κυττάρων του συζύγου (αντιπατρικά αντισώματα), όσο και έναντι panel ατόμων. γ) Ανοσοφαινοτυπική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής των υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος των γυναικών με τη μέθοδο του άμεσου τριπλού ανοσοφθορισμού καθώς και των υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων του ζεύγους με τετραχρωματική ανάλυση πλήρους αίματος. δ) Προσδιορισμό του τύπου της ανοσιακής απάντησης Th1 (IFN-γ, IL-2) ή Th2 (IL-4, IL-10) στο περιφερικό αίμα των γυναικών σε κυτταρομετρητή ροής με τη μέθοδο των ενδοκυττάριων κυτταροκινών και την τεχνική του άμεσου τριπλού ανοσοφθορισμού σε πλήρες αίμα. ε) Έλεγχο για την παρουσία αυτοαντισωμάτων στον ορό των γυναικών από τα οποία τα αντιπυρηνικά και τα έναντι διπλής έλικας DNA προσδιορίστηκαν με έμμεσο ανοσοφθορισμό, ενώ τα αντισώματα έναντι εκχυλιζομένων αντιγόνων του πυρήνα, τα αντιθυρεοειδικά και τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα (έναντι καρδιολιπίνης, έναντι φωσφατιδυλσερίνης και έναντι β2 γλυκοπρωτεΐνης Ι), προσδιορίστηκαν με ELISA. Επιπλέον, ανίχνευση του αντιπηκτικού του λύκου στο πλάσμα των γυναικών έγινε με τη μέθοδο Diluted Lussell’s viper venom time. Αποτελέσματα: α) Από τη μελέτη των HLA αντιγόνων δεν ανευρέθησαν διαφορές όσον αφορά την πληθυσμιακή τους κατανομή και τον αριθμό των κοινών αντιγόνων που τα ζευγάρια μοιράζονται, στην ομάδα των ΕΑΑ σε σύγκριση με τους μάρτυρες. β) Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά των λεμφοκυτταροτοξικών αντισωμάτων έναντι των κυττάρων του συζύγου (αντιπατρικά αντισώματα) και των λεμφοκυτταροτοξικών αντισωμάτων έναντι panel ατόμων στις γυναίκες που ελέγχθηκαν. γ) Διαπιστώθηκε αύξηση των ΝΚ λεμφοκυττάρων (p=0.003) και υποπληθυσμών τους (CD3-CD56+, p=0.003 και CD3-CD16-CD56+, p<0.0001) καθώς και των TCRγδ+ Τ λεμφοκυττάρων (p=0.007) περιφερικού αίματος στην ομάδα των γυναικών με ΕΑΑ. δ) Η μελέτη του ρεπερτορίου υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων ανέδειξε μειωμένη έκφραση των KIR2DL1 (CD158a) και KIR2DL2/3 (CD158b) ανασταλτικών υποδοχέων στις γυναίκες με ΕΑΑ σε σχέση με τους συντρόφους τους σε επίπεδο στατιστικά σημαντικό (p=0.012 και p=0.014, αντιστοίχως) ε) Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά τον τύπο της ανοσιακής απάντησης (κυτταροκίνες Th1/Th2). στ) Προσδιορίστηκε αυξημένη παρουσία αντιθυρεοειδικών αντισωμάτων στις γυναίκες με ΕΑΑ σε σύγκριση με τους μάρτυρες (p=0.04). Τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα στο σύνολό τους εμφάνισαν αυξημένη επίπτωση (p=0.02) στην ομάδα των ΕΑΑ, η οποία δεν παρέμεινε στατιστικά σημαντική όταν καθένα από τα αντισώματα αυτά μελετήθηκε ξεχωριστά.Συμπέρασμα: Σύνθετοι ανοσολογικοί μηχανισμοί εμπλέκονται στην παθογένεια των ΕΑΑ. Ο έλεγχος των ανοσολογικών παραμέτρων κρίνεται σκόπιμος καθώς μπορούν να αποτελέσουν χρήσιμο προγνωστικό δείκτη και να καθοδηγήσουν τη θεραπευτική στρατηγική. Περαιτέρω έρευνα και σε άλλα πεδία και παραμέτρους της ανοσιακής απάντησης είναι απαραίτητη για την συναξιολόγηση και ανάπτυξη νέων διαγνωστικών προσεγγίσεων και το σχεδιασμό αποτελεσματικών θεραπευτικών πρωτοκόλλων.