Μελέτη ανοσολογικών μηχανισμών που ενέχονται στη χρονιότητα της λοιμώξεως με Brucella

Abstract

Brucella, a facultative intracellular bacterium that causes undulant fever, endocarditis, arthritis and osteomyelitis in humans, establishes chronic infections by infecting, surviving and replicating in different cell types, including macrophages and dendritic cells. B. abortus, B. melitensis and B. suis are the main species that cause human brucellosis, with B. melitensis causing the majority of cases and the most severe symptoms.The capacity of Brucella to persist in infected cells depends on its stealthy strategy to avoid or interfere with components of the host innate and acquired immune responses. Initial host defenses against bacterial infection are stimulated by PAMPs, which are recognized by the host. Ample evidence implicates the different members of TLR family in recognition of Brucella and/or clearance of infection.One essential branch of signaling cascades initiated by TLR is the ubiquitously expressed family of MAPKs. MAPKs mediate cellular responses to a variety of extracellular stimuli, such as physical stress, inflammatory cytokines, growth factors and bacterial components.Object of the study was the investigation of MAPK orchestration of the innate immune response against pathogenic live clinical strains of B. melitensis in fresh human monocytes.Initially it has been shown that Brucella induced a strong pro-inflammatory response resulting in the release of high levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α and simultaneously triggered a strong anti-inflammatory response that lasted for a short time. Namely, live Brucellae do not avoid the initial recognition and trigger a strong inflammatory response.Moreover, TNF-α, IL-6 and IL-10 production induced by Brucella was strongly inhibited in the presence of anti-TLR2, whereas it remained unaffected by the presence of anti-TLR4. IL-1β was not influenced either by TLR2 or TLR4 neutralization. Blocking by anti-TLR2, but not anti-TLR4, markedly reduced both p38 and ERK activation to basal levels in response to Brucella infection. Additionally, IL-1β production by Brucella-infected monocytes remained unaffected by the addition of MAPK inhibitors. Inhibition of p38 significantly diminished IL-6 production and almost completely prevented TNF-α release, whereas inhibition of ERK1/2 significantly reduced both. JNK inhibition had no effect on TNF-α and IL-6 production. IL-10 production was markedly reduced by p38 or JNK inhibition, but not MAP2K. These results suggest that MAPK activation is an important intracellular event leading to cytokine production in the course of Brucella infection.Finally, MAPK activation affects the survival of Brucella in human monocytes. Inhibition of p38 or JNK almost completely repressed Brucella growth, whereas inhibition of ERK did not reduce the multiplication rate of Brucella. In conclusion, it has been demonstrated that infection with B. melitensis induces a late activation of ERK and p38 that affects cytokine release in a TLR2-dependent manner. Moreover, MAPK activity is beneficial for replication of Brucella inside human monocytes.MAPK activation could affect a number of mechanisms involved in the intracellular survival of B. melitensis. MAPK activity is involved in the transport to the early endosome, early acidification of the phagosome, signaling for induction of the VirB Type IV secretion system, or regulation of the autophagic pathway. Current studies in our laboratory investigate these possibilities.

Η βρουκέλλα, ένα προαιρετικώς ενδοκυττάριο βακτήριο που προκαλεί μελιταίο πυρετό, ενδοκαρδίτιδα, αρθρίτιδα και οστεομυελίτιδα στους ανθρώπους, εγκαθιστά χρόνιες λοιμώξεις μολύνοντας, επιβιώνοντας και πολλαπλασιαζόμενη σε διαφόρους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των μονοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων. Οι B. abortus, B. melitensis και B. suis είναι τα κύρια είδη που προκαλούν βρουκέλλωση στους ανθρώπους και η B. melitensis προκαλεί την πλειονότητα των περιστατικών και την πιο βαριά συμπτωματολογία.Η ικανότητα της βρουκέλλας να παραμένει στα μολυσμένα κύτταρα εξαρτάται από την ιδιότητά της να αποφεύγει ή να αλληλεπιδρά με στοιχεία των απαντήσεων της φυσικής και επίκτητης ανοσίας. Η αρχική άμυνα του ξενιστή έναντι βακτηριακών λοιμώξεων διεγείρεται από PAMP, που αναγνωρίζονται από τον ξενιστή. Πληθώρα αποδείξεων εμπλέκουν διαφορετικά μέλη της οικογένειας των TLR στην αναγνώριση της βρουκέλλας και/ή στην εκκαθάριση της λοιμώξεως. Ένας απαραίτητος κλάδος των σηματοδοτικών οδών που ξεκινά από τους TLR είναι η οικογένεια των MAP κινασών. Οι MAP κινάσες διαμεσολαβούν κυτταρικές απαντήσεις σε ποικιλία εξωτερικών διεγέρσεων, όπως το φυσικό στρες, οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, οι αυξητικοί παράγοντες και συστατικά των βακτηρίων. Αντικείμενο της μελέτης ήταν η διερεύνηση της ενορχήστρωσης των απαντήσεων της φυσικής ανοσίας έναντι ζωντανών παθογόνων κλινικών στελεχών B. melitensis σε ανθρώπινα μονοκύτταρα από τις MAP κινάσες.Αρχικά απεδείχθη ότι η βρουκέλλα προκάλεσε ισχυρή προφλεγμονώδη απάντηση με αποτέλεσμα την απελευθέρωση υψηλών επιπέδων IL-1β, IL-6 και TNF-α και ταυτοχρόνως πυροδότησε έντονη, μικρής διαρκείας αντιφλεγμονώδη απάντηση. Δηλαδή, η ζωντανή βρουκέλλα δεν αποφεύγει την αρχική αναγνώριση και κινητοποιεί ισχυρή προφλεγμονώδη απάντηση από τη φυσική ανοσία. Επιπλέον, η παραγωγή TNF-α, IL-6 και IL-10 που προκλήθηκε από τη βρουκέλλα ανεστάλη παρουσία αντι-TLR2, ενώ παρέμεινε ανεπηρέαστη παρουσία αντι-TLR4 αντισώματος. Η IL-1β δεν επηρεάστηκε από την εξουδετέρωση είτε του TLR2 ή του TLR4. Η διακοπή της σηματοδότησης διαμέσου του TLR2, αλλά όχι του TLR4, μείωσε σημαντικά την ενεργοποίηση αμφοτέρων των p38 και ERK ως απάντηση στη μόλυνση με βρουκέλλα. Επιπρόσθετα, η παραγωγή IL-1β από μονοκύτταρα μολυσμένα με βρουκέλλα παρέμεινε ανεπηρέαστη από την προσθήκη αναστολέων των MAP κινασών. Αναστολή της p38 ελάττωσε σημαντικά την παραγωγή IL-6 και εμπόδισε σχεδόν πλήρως την απελευθέρωση TNF-α, ενώ αναστολή της ERK1/2 μείωσε αξιοσημείωτα και τις δύο. Αναστολή της JNK δεν επηρέασε την παραγωγή TNF-α και IL-6. Η παραγωγή IL-10 μειώθηκε σημαντικά από αναστολή των p38 ή JNK, αλλά όχι από αυτήν της MAP2K. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση των MAP κινασών είναι σημαντικό ενδοκυττάριο στάδιο στην παραγωγή κυτταροκινών στην πορεία της βρουκελλώσεως. Τέλος, η ενεργοποίηση των MAP κινασών επηρεάζει την επιβίωση της βρουκέλλας εντός των ανθρωπίνων μονοκυττάρων. Η αναστολή της p38 ή της JNK κατέστειλε σχεδόν πλήρως την αύξηση της βρουκέλλας, ενώ αναστολή της ERK δεν μείωσε τον πολλαπλασιασμό της. Συμπερασματικά, καταδεικνύεται ότι η λοίμωξη με B. melitensis προκαλεί όψιμη ενεργοποίηση των ERK και p38 η οποία επηρεάζει την απελευθέρωση κυτταροκινών διαμέσου του TLR2. Ακόμη, η δράση των MAP κινασών είναι επωφελής για τον πολλαπλασιασμό της βρουκέλλας εντός των ανθρωπίνων μονοκυττάρων.Οι MAP κινάσες ενδέχεται να επηρεάζουν διαφορετικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ενδοκυττάρια επιβίωση της B. melitensis. Επί παραδείγματι, εμπλέκονται στη μεταφορά στο πρώιμο ενδόσωμα, την πρώιμη οξίνιση του φαγοσώματος, τη σηματοδότηση της επαγωγής του εκκριτικού συστήματος τύπου IV VirB ή τη ρύθμιση της σηματοδότησης της αυτοφαγίας. Τρέχουσες έρευνες του εργαστηρίου εξετάζουν τα συγκεκριμένα ενδεχόμενα.