Μελέτη γονιδίων που εμπλέκονται στις συγγενείς ανωμαλίες του ουροποιητικού (CAKUT)

Abstract

IntroductionCongenital anomalies of kidney and urinary tract account for almost 0,5% of all pregnancies and are the most often cause of chronic kidney disease in infants and young children. About 30-40% of children with chronic renal disease or end stage renal disease have congenital anomalies of kidney and urinary tract. One of the most frequent is vesico-ureteric reflux (VUR), which is often accompanied by renal hypodysplasia (VUR-RHD). To date, the heritability and the pathogenesis of these anomalies has not been established. ROBO2 gene is involved during nephrogenesis at the early stage of the ureteric bud induction. However, in the literature it is not clear if the gene is implicated in the pathogenesis of VUR.ObjectivesThe aim of the present study is to evaluate the presence of sequence variations in the ROBO2 gene in children with VUR and VUR-RHD. In silico evaluation was also performed for factors that can epigenetically affect the gene’s expression.Materials and MethodsA total of 103 pediatric patients were studied: 65 with VUR (10 familial VUR) and 38 with VUR-RHD. A control group of 200 healthy children, age and sex matched with the patients were also screened.The gene screening was performed by single strand conformation polymorphism (SSCP) or multiple restriction fragment (MRF)-SSCP electrophoresis, in two different running conditions. Subsequently the samples with variations were characterized by direct DNA sequencing. The control group was screened using restriction enzymes or MRF-SSCP. Statistical analysis (chi-square test) was carried out as well as in silico analysis for the nucleotide changes that were found (ESEfinder and SplicePort). In silico analysis was also performed regarding the content of the gene in CpG islands (EMBOSS CpGPlot), the homology with miRNAs (miRBase) and the content in transposable elements (UCSC Genome Bioinformatics, RepeatMasker).Results The Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) IVS1-53G>A (rs9874095) and IVS5-31A>G (rs76571990) were found. Statistical analysis for IVS1-53G>A showed a significance difference toward the control group and in silico analysis showed that the SNP does not affect mRNA splicing. The second SNP, IVS1-53G>A, is reported for the first time, even though it is already recorded, and was detected only in one of the patients. In silico results demonstrated an alteration in two SR proteins’ binding (ESEfinder) and two additional acceptor sites (SplicePort), exhibiting a high possibility for the splice site to be affected. The gene has eight CpG islands >200 nucleotides long. The sequence of the gene displays homology with 17 mature miRNAs and 60 pre-miRNAs. Higher score and e-value<0,1 had 3 mature miRNAs and 25 pre-miRNAs. The alignment with the mature miRNAs has a difference from 1-3 bases, whereas with the pre-miRNAs >10 bases. Also the sequence of the gene has a content of 25,9% in transposable elements, including DNA transposons (4,55%), although the last do not participle in any biological procedure, until today. ConclusionsThe results so far indicate that mutations in ROBO2 are not a major cause of VUR and VUR-RHD in our studied patients, reinforcing the findings for genetic heterogeneity of these anomalies. Even though the gene’s implication in the presence of VUR has been reported before, in this study it could not be confirmed, underlining the fact that VUR and VUR-RHD are multifactorial disorders. Besides the changes in the nucleotide sequence, gene expression can be affected epigenetically from factors like methylation, through CpG islands, miRNAs or transposable elements. According to the results of the present study, the ROBO2 gene could be affected by these factors as (1) it contains eight CpG islands, (2) it has homology with 3 mature miRNAs with high affinity and 25 pre-miRNAs with less and (3) the 21.35% of its sequence are transposable elements. These factors can reduce the gene expression or even silence it, resulting in the pathogenesis of the anomalies studied, even though the gene’s sequence is not altered. In total, the study of congenital anomalies of kidney and urinary tract in human is extremely difficult and their research should focus in more complete models, with cell lines or with tissue from biopsies whenever it is possible.

Οι συγγενείς ανωμαλίες του ουροποιητικού συστήματος ανευρίσκονται περίπου στο 0,5% όλων των κυήσεων και αποτελούν την πλέον συχνή αιτία τελικού σταδίου χρόνιας νεφρικής νόσου στα βρέφη και μικρά παιδιά. Περίπου το 30-40% των παιδιών με χρόνια νεφρική ανεπάρκεια ή τελικού σταδίου νεφρική ανεπάρκεια εμφανίζουν συγγενείς ανωμαλίες του ουροποιητικού. Από τις πιο συχνές είναι η κυστεοουρητηρική παλινδρόμηση (ΚΟΠ), η οποία συχνά συνοδεύεται από νεφρική υποπλασία/δυσπλασία (ΝΥΔ). Έως σήμερα η κληρονομικότητα και η παθογένεια αυτών των ανωμαλιών δεν έχει εξακριβωθεί. Το γονίδιο ROBO2 συμμετέχει στο αρχικό στάδιο της νεφρογένεσης που χαρακτηρίζεται από την επαγωγή ανάπτυξης της ουρητηρικής καταβολής (ΟΚ). Ωστόσο, δεν υπάρχει ομοφωνία στη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά με την συμμετοχή αυτού του γονιδίου στην παθογένεια της ΚΟΠ.ΣκοπόςΟ σκοπός της διδακτορικής διατριβής είναι ο έλεγχος για την ύπαρξη μεταλλάξεων του γονιδίου ROBO2 σε παιδιά με ΚΟΠ και ΚΟΠ-ΝΥΔ. Επιπλέον ελέγχθηκαν in silico παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν επιγενετικά την έκφραση του γονιδίου. Υλικά και μέθοδοι Ελέγχθηκαν για νουκλεοτιδικές αλλαγές 103 παιδιατρικοί ασθενείς: 65 με ΚΟΠ (10 με οικογενή ΚΟΠ) και 38 με ΚΟΠ-ΝΥΔ. Επιπλέον ελέγχθηκαν 200 παιδιά παρόμοιας ηλικίας και φύλου με τους ασθενείς που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου.Η ανάλυση στους ασθενείς πραγματοποιήθηκε με τις μεθόδους SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) ή MRF-SSCP (Multiple Restriction Fragment-SSCP), σε δύο διαφορετικές συνθήκες. Στα δείγματα που τα πρότυπα ζωνώσεων απέκλιναν από το φυσιολογικό, πραγματοποιήθηκε ανάλυση αλληλουχίας DNA (DNA sequencing). Η ομάδα ελέγχου ελέγχθηκε με περιοριστικές ενδονουκλεάσες ή με MRF-SSCP. Πραγματοποιήθηκε στατιστική (χ2 τέστ) και in silico ανάλυση για τις νουκλεοτιδικές αλλαγές που βρέθηκαν (ESEfinder και SplicePort). In silico ανάλυση πραγματοποιήθηκε επίσης για την περιεκτικότητα του γονιδίου σε CpG νησίδες (EMBOSS CpGPlot), την ομολογία του με miRNAs (miRBase) και την περιεκτικότητα του σε μεταθετά στοιχεία (UCSC Genome Bioinformatics, RepeatMasker).Αποτελέσματα Από την ανάλυση του γονιδίου, εντοπίστηκαν δύο πολυμορφισμοί: o IVS1-53G>A (rs9874095) και ο IVS5-31A>G (rs76571990). Για τον IVS1-53, το χ2 τεστ έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά υπέρ των μαρτύρων και η in silico ανάλυση έδειξε ότι δεν επηρεάζεται η αντίστοιχη περιοχή ματίσματος. Ο IVS5-31 ο οποίος αναφέρεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία, παρόλο που είναι καταγεγραμμένος στη βάση δεδομένων, βρέθηκε μόνο σε έναν ασθενή. Τα in silico αποτελέσματα για την επίδραση του στο μάτισμα του mRNA έδειξαν αλλαγή της σύνδεσης δύο SR πρωτεϊνών (ESEfinder) και δύο επιπλέον αλληλουχίες δέκτες (SplicePort), επομένως πιθανότατα αυτός ο πολυμορφισμός επηρεάζει το μάτισμα. Όσο αφορά την περιεκτικότητα του γονιδίου σε CpG νησίδες φέρει συνολικά οκτώ, μεγέθους >200 νουκλεοτίδια. Η αλληλουχία του ROBO2 έχει ομολογία με 17 ώριμα και 60 ανώριμα miRNAs. Μεγαλύτερη βαθμολογία και e-value<0,1 παρουσιάζουν 3 ώριμα και 25 ανώριμα. Η στοίχιση στα ώριμα έχει διαφορά από 1-3 νουκλεοτίδια ενώ στα ανώριμα miRNAs, τα περισσότερα έχουν διαφορά >10 νουκλεοτίδια. Η περιεκτικότητα του γονιδίου ROBO2 σε μεταθετά στοιχεία είναι 25,9% συμπεριλαμβανομένου των DNA τρανσποζονίων (4,55%), τα οποία όμως μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν σε κάποια βιολογική διεργασία. ΣυμπεράσματαΟι νουκλεοτιδικές αλλαγές του γονιδίου ROBO2 δε βρέθηκε να είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση ΚΟΠ ή ΚΟΠ-ΝΥΔ στον πληθυσμό της μελέτης, ενισχύοντας την υποκείμενη γενετική ετερογένεια αυτών των νοσημάτων. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις του γονιδίου ROBO2 συσχετίζονται με την παρουσία ΚΟΠ, η παρούσα μελέτη δεν επιβεβαίωσε μια τέτοια συσχέτιση, υπογραμμίζοντας το γεγονός ότι η ΚΟΠ και η ΚΟΠ-ΝΥΔ είναι πολυπαραγοντικά νοσήματα. Ωστόσο, εκτός από τις αλλαγές στη αλληλουχία του DNA, η έκφραση του γονιδίου μπορεί να επηρεαστεί επιγενετικά από παράγοντες όπως είναι η μεθυλίωση, μέσω των CpG νησίδων, τα miRNAs ή τα μεταθετά στοιχεία. Από τα αποτελέσματα της μελέτης βρέθηκε ότι το γονίδιο ROBO2 είναι πιθανό να επηρεάζεται από αυτούς τους παράγοντες, καθώς (1) περιέχει οκτώ CpG νησίδες, (2) έχει ομολογία με υψηλή στοίχιση με 3 ώριμα miRNAs και με μικρότερη με 25 ανώριμα miRNAs και (3) το 21,35% της αλληλουχίας του είναι μεταθετά στοιχεία. Αυτοί οι παράγοντες ρύθμισης είναι πιθανό να μειώνουν την έκφραση του γονιδίου, ή να το αποσιωπούν, και έτσι να συμβάλουν στην εμφάνιση των ανωμαλιών που μελετήθηκαν, παρά την απουσία συγκεκριμένων νουκλεοτιδικών αλλαγών. Συνολικά, από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η προσέγγιση των συγγενών ανωμαλιών του ουροποιητικού στον άνθρωπο είναι εξαιρετικά δύσκολη και θα πρέπει να επικεντρωθεί σε πιο ολοκληρωμένα μοντέλα μελέτης, με κυτταρικές σειρές ή όπου είναι δυνατόν να μελετηθεί ιστός από νεφρικές βιοψίες.