Μελέτη έκφρασης γονιδίων ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου σε διάχυτα από μεγάλα κύτταρα Β μη Hodgkin λεμφώματα: συμβολή στην προγνωστική αξιολόγηση

Abstract

Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is an aggressive malignancy of mature B cells with heterogeneous prognosis. Biological markers have been used in an attempt to improve the discriminative capacity of the International Prognostic Index (IPI). Abnormalities of cell cycle constitute a marker of clonal expansion and may contribute to disease progression; thus the investigation of cell cycle regulatory genes may be of prognostic relevance. The aim of the present study was the investigation of gene expression levels of cell cycle regulatory genes in DLBCL and their relation to prognosis. The analysis included 45 newly diagnosed cases of diffuse large B-cell lymphomas and 18 cases of non-neoplastic lymphadenopathies used as controls. The IPI was available for all lymphoma cases. RNA was extracted from fresh frozen tissues and analyzed by RNase Protection Assay (RPA) with Riboquant kit (BD Biosciences). Two sets of probes were used that included cyclins, cyclin dependent kinases and their inhibitors. In more detail h-CC1 set of probes detected mRNA for the genes cdk-1, cdk-2, cdk-3, cdk-4, p16, p27, p21, PISSLRE and h-CYC1 set of probes detected mRNA for the genes of cyclins A, B, C, D1, D2, D3 and A1. The intensity of each band was compared to that of the housekeeping genes GAPDH and L32 using the Image Master Software (Pharmacia). Moreover, immunohistochemistry was performed on paraffin-embedded tissue sections in order to verify the expression of germinal center proteins, bcl6 and CD10 and MUM1/interferon regulatory factor (IRF)4.The expression levels of the cell cycle regulatory genes did not correlate with any of the clinical parameters nor the prognostic markers. 85% of patients that didn’t have complete remission to first line therapy, expressed the cyclinA1 (p=0,047). 92% of the patients with low IPI (0,1) expressed PISSLRE, while only 56% of the patients with high IPI (2,3,4,5), expressed this gene. Moreover, cdk2 and cdk4 expression levels were significantly higher in cases expressing bcl-6 protein (p=0,013, p=0,04 respectively). The mean expression level of cyclin B was higher in cases with positive expression of protein CD10 (p=0,007). All patients with negative expression of CD10 had a lower expression level of cyclinA1 compared to normal RNA pool (p=0,037). Moreover, patients expressing cyclinA1 had significantly shorter disease free survival (p=0,03), while the expression of PISSLRE was associated with significantly better overall survival (p=0,0329).Taking into consideration the heterogeneity of clinical behaviour of DLBCL, the cell cycle regulatory genes may serve as biologic markers with prognostic significance. Our study has shown that the expression level of cyclinA1 is associated with significantly lower response to first line therapy and lower disease free survival. Moreover the expression of PISSLRE seems to be associated with low risk disease and higher overall survival, which emphasizes the potential role of this gene as a tumour suppressor.

Τα διάχυτα από μεγάλα κύτταρα λεμφώματα Β κυτταρικής σειράς χαρακτηρίζονται από επιθετική και ετερογενή βιολογική συμπεριφορά. Σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση των διαταραχών των γονιδίων που συμμετέχουν στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου καθώς και η συσχέτιση της έκφρασής τους με τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών και την πρόγνωση.Η μελέτη περιέλαβε 45 νεοδιαγνωσθείσες περιπτώσεις διάχυτων από μεγάλα κύτταρα λεμφωμάτων Β κυτταρικής σειράς και 18 περιπτώσεις αντιδραστικής λεμφαδενοπάθειας που χρησιμοποιήθηκαν σαν ομάδα μαρτύρων. Προσδιορίστηκε ο Διεθνής Προγνωστικός Δείκτης (IPI) για όλες τις περιπτώσεις μη-Hodgkin λεμφωμάτων. Ο έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου έγινε σε επίπεδο RNA με τη δοκιμασία προστασίας από ριβονουκλεάσες (RPA) με τη χρήση του Riboquant Kit (BD Biosciences). Τα γονίδια τα οποία μελετήθηκαν αφορούσαν τα γονίδια των κυκλινών, των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών και των αναστολέων τους. Χρησιμοποιήθηκαν δύο ομάδες ιχνηλατών: το hCC-1 το οποίο ανιχνεύει mRNA για τα γονίδια των cdk-1, cdk-2, cdk-3, cdk-4, p16, p27, p21, PISSLRE και το hCYC-1 για τα γονίδια των κυκλινών Α, Β, C, D1, D2, D3 και Α1. Επίσης προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημική μέθοδο η έκφραση των γονιδίων του βλαστικού κέντρου bcl-6 και CD10 καθώς και ο δείκτης MUM, για να προσδιοριστεί η προέλευση των λεμφωμάτων.Η ένταση της έκφρασης των γονιδίων που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο όπως προσδιορίστηκε σε σχέση με τα γονίδια ευρείας έκφρασης δεν σχετιζόταν με καμία κλινική παράμετρο και προγνωστικούς δείκτες. Το 87% των ασθενών που πέθαναν από τη νόσο δεν παρουσίαζαν έκφραση του γονιδίου p27 (p=0,013). Ένα άλλο ενδιαφέρον στοιχείο ήταν ότι το 75% των ασθενών με φυσιολογική LDH παρουσίασαν έκφραση του γονιδίου p21 (p=0,019). Η έκφραση της κυκλίνης Α1 φάνηκε να σχετίζεται με απουσία πλήρους ύφεσης στη θεραπεία πρώτης γραμμής (p=0,047). Τo 92% των ασθενών με IPI 0,1 παρουσίαζε έκφραση του γονιδίου PISSLRE, ποσοστό σημαντικά μικρότερο σε σχέση με τους ασθενείς υψηλότερου κινδύνου (IPI 2-5) (p=0,04). H επιβίωση ελεύθερη νόσου ήταν σημαντικά μικρότερη στους ασθενείς με έκφραση της κυκλίνης Α1 (p=0,03). Η έκφραση του γονιδίου PISSLRE σχετίζεται με σημαντικά καλύτερη επιβίωση (p=0,0329).Στην ετερογενή ομάδα των διάχυτων από μεγάλα κύτταρα Β λεμφωμάτων τα γονίδια ελέγχου του κυτταρικού κύκλου μπορεί να συμβάλλουν στην προγνωστική αξιολόγηση των ασθενών. Πιο συγκεκριμένα, η έλλειψη της έκφρασης του p27 φάνηκε να συνδυάζεται με υψηλότερα ποσοστά θανάτων από τη νόσο, ενώ η έκφραση της κυκλίνης Α1 με χαμηλότερα ποσοστά ανταπόκρισης στη θεραπεία και με χαμηλότερη επιβίωση ελεύθερη νόσου. Η έκφραση του γονιδίου PISSLRE σχετιζόταν με σημαντικά καλύτερη επιβίωση υποδηλώνοντας το ρόλο αυτού του γονιδίου ως πιθανού ογκοκατασταλτικού. Τα ανωτέρω αποτελέσματα θα πρέπει να εκτιμηθούν και σε ανοσοϊστοχημικό επίπεδο για περαιτέρω επιβεβαίωση.