Μοριακή μελέτη των γονιδίων των πρωτεϊνών του ριβοσωμικού μίσχου, της υπεροξειδικής δισμουτάσης και της κινάσης της καζεΐνης 2 στο μύδι Mytilus galloprovincialis

Abstract

Bivalve molluscs such as Mytilus galloprovincialis have been proposed as bio-indicators of marine pollution, as they are able to accumulate in their tissues a wide range of pollutants and respond with a broad range of alterations that can be measured as exposure or effect biomarkers. Cellular stress caused by environmental contamination has been, also, shown to cause spatial and seasonal variability in global protein synthesis in the mussel M. galloprovincialis.The main purpose of this Ph.D. thesis was to study the P-proteins MgΡ0, MgΡ1 and MgΡ2 of the ribosomal stalk and to explore the role of Protein Kinase CK2 and Superoxide Dismutase in the activity of these P-proteins, which is crucial in the regulation of gene expression during translation. The eukaryotic ribosomal stalk, a pentameric protuberance of P0(P1)2(P2)2 proteins, interacts with the elongation factor EF-2 and plays an important role in the regulation of protein synthesis. P0 protein seems to be overexpressed in cancer and under stress conditions. Reversible phosphorylation of Ρ1/Ρ2 proteins participates in the control of ribosomal activity. This phosphorylation is catalyzed by Protein Kinase CK2. Protein kinase CK2 has traditionally been classified as a messenger-independent protein serine/threonine kinase that is typically found in tetrameric complexes consisting of two catalytic (α and/or α΄) subunits and two regulatory β subunits. Superoxide Dismutase (SOD) interacts with CK2 and inhibits the phosphorylation of the P1/P2 proteins. The phosphorylation of the ribosomal stalk controls the activity of ribosomes. So, the study of the P-proteins of the ribosomal stalk is important to understand its role in the control of gene expression.During this graduate thesis a number of molecular, genetic, microbiological and biochemical techniques were applied in order to study the ribosomal stalk. Isolation of M. galloprovincialis ribosomes and analysis of ribosomal proteins MgP0, MgP1 and MgP2 with electrophoresis and Western Blot analysis showed that P0 has a MW of 32kDa, while P1 and P2 were found acidic with pI 3 and 4, respectively, a MW of 14kD and were phosphorylated in the ribosomes. In parallel, in vivo study of endogenous MgP0 after exposure of the mussels at Cadmium and Sorbitol showed overexpression in transcriptional and translational level after semi-quantitative RT-PCR and Western blot analysis, respectively.The cDNAs of MgP0 and MgSOD were isolated by screening a cDNA library, while the cDNAs of MgP1 and MgP2 by RT-PCR according to published ESTs (AJ624169 και AJ625889). The recombinant proteins MgP0, MgP1, MgP2 and MgSOD were purified with IMAC chromatography after expression of their cDNAs in Escherichia coli.In order to isolate the native Protein Kinase CK2 of M. galloprovicnialis, ion exchange chromatography was performed. Active fractions containing the CK2α catalytic subunit were isolated by DEAE-cellulose and phosphocellulose chromatography. These collected fractions were confirmed for CK2α activity with Kinase Assay experiments, using as substrate M. galloprovincialis purified recombinant ribosomal protein rMgP1 and yeast ScP2b and were tested in the presence of several known modulators of the CK2 activity, like heparin and rMgSOD, ATP-competetive inhibitor (TBBt), and inducer (Spermine).For better understanding the properties and regulatory mechanisms of CK2 the cDNAs of α- and β-subunits were constructed with 5΄/3΄RACE and RT-PCR, respectively. Both proteins were expressed in E.coli and purified to homogeneity. Analysis of their predicted amino acid sequences showed that the CK2α and CK2β presents the characteristic subdomains and the conserved features of a typical protein kinase CK2. The recombinant proteins MgCK2α and MgCK2β are active as showed from the results of Kinase Assay experiments, while rMgCK2α was able to phoshorylate rMgCK2β and rMgP1.In this thesis ribosomal P-proteins, Superoxide Dismutase and Protein Kinase CK2, as well as its subunits (CK2 and CK2β) were studied and isolated for the first time from marine invertebrates and especially from the mussel M. galloprovincialis. The ribosomal stalk controls the activity of ribosomes and the isolation of the protein kinase CK2, which phosphorylates stalk’s proteins, will contribute to our knowledge about regulation of translation through gene expression under normal and stress conditions. Furthermore, according to experimental evidences P0, SOD and CK2 of M.galloprovincialis could be used as biomarkers of marine pollution.

Το Μεσογειακό μύδι Mytilus galloprovincialis είναι ένας οργανισμός μεγάλης οικονομικής σημασίας, ιδίως για την Ελλάδα, η οποία κατέχει τη δεύτερη θέση παραγωγής μυδιών στην Ευρώπη, μετά την Ισπανία. Χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης θαλάσσιας ρύπανσης, καθώς παρουσιάζει αυξημένη δυνατότητα συσσώρευσης οργανικών ρύπων στους ιστούς του, οι οποίοι μπορεί να προκαλέσουν σημαντικές δομικές ανωμαλίες στο ριβοσωμικό RNA ή τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες και τελικά αλλαγές στη πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή.Στην εργασία αυτή μελετήθηκε ο ριβοσωμικός μίσχος του μυδιού και η πρωτεϊνική κινάση CΚ2, η οποία είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των P- πρωτεϊνών. Ο ριβοσωμικός μίσχος είναι μια προεξοχή της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελείται από ένα πρωτεϊνικό πενταμερές, Ρ0(Ρ1/Ρ2)2 , που αλληλεπιδρά με τους παράγοντες επιμήκυνσης κατά την πρωτεϊνοσύνθεση. Οι Ρ-πρωτείνες βρίσκονται φωσφορυλιωμένες στα ριβοσώματα και η φωσφορυλίωση φαίνεται να επηρεάζει την ενεργότητα τους. Η φωσφορυλίωση των Ρ-πρωτεϊνών πραγματοποιείται από την πρωτεϊνική κινάση CK2, η οποία έχει δομή τετραμερούς (α2β2), και αποτελείται από δύο καταλυτικές υπομονάδες (α ή α΄) και μία διμερή β ρυθμιστική υπομονάδα. Η φωσφορυλίωση των Ρ-πρωτεϊνών από τη πρωτεϊνική κινάση CK2 αναστέλλεται από την υπεροξειδική δισμουτάση SOD, ένα αντιοξειδωτικό ένζυμο που συμμετέχει στην άμυνα του οργανισμού έναντι οξειδωτικής βλάβης.Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, αρχικά έγινε βιοχημική ανάλυση των Ρ-πρωτεϊνών MgΡ0, MgΡ1 και MgΡ2 με ηλεκτροφορητικές μεθοδους και ανάλυση κατά Western με ειδικά αντισώματα. Η Ρ0 έχει ΜΒ 32kDa, ενώ οι MgP1 και MgP2 είναι όξινες, μικρού ΜΒ και βρισκονται φωσφορυλιωμένες στα ριβοσώματα. Έλεγχος της ενδογενούς πρωτεΐνης MgΡ0 μετά από έκθεση των μυδιών σε κάδμιο και σορβιτόλη (συνθήκες καταπόνησης-στρες) έδειξε υπερέκφραση, τόσο σε μεταφραστικό όσο και σε μεταγραφικό επίπεδο.Ακολούθησε κατασκευή των cDNAs των MgΡ0, MgΡ1, MgΡ2 και MgSOD πρωτεϊνών. Τα MgP0 και MgSOD cDNAs απομονώθηκαν με σάρωση cDNA βιβλιοθήκης, ενώ τα MgP1 και MgP2 κατασκευάσθηκαν με τη μέθοδο RT-PCR. Οι ανασυνδυασμένες MgΡ0, MgΡ1, MgΡ2, MgSOD πρωτεΐνες απομονώθηκαν με έκφραση των cDNA μορίων τους σε κύτταρα Escherichia coli και χρωματογραφία συγγένειας. Επόμενο βήμα της διατριβής ήταν η απομόνωση της υπεύθυνης για τη φωσφορυλίωση των Ρ-πρωτεϊνών πρωτεϊνικής κινάσης CK2. Αρχικά, επιχειρήθηκε απομόνωση της ενδογενούς πρωτεϊνικής κινάσης CK2 από βράγχια του μυδιού M. galloprovincialis με ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία, που οδήγησε στην απομόνωση ενεργών κλασμάτων με την ενδογενή καταλυτική υπομονάδα CK2α. Η παρουσία της CK2α στα κλάσματα επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία κινάσης (kinase assay) και φωσφορυλίωση των ανασυνδυασμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών MgΡ1 και MgΡ2 του μυδιού και ScΡ2β του ζυμομύκητα, καθώς και αναστολή της από ειδικούς αναστολείς (ηπαρίνη και ΤΒΒt) και ενισχυτές (σπερμίνη). Ακολούθησε μοριακή μελέτη της ΜgCK2 με κατασκευή των cDNA μορίων της καταλυτικής ΜgCK2α και της ρυθμιστικής ΜgCK2β υπομονάδας με μεθόδους 5΄και 3΄ RACE και RT-PCR, αντίστοιχα, και απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μετά από έκφραση σε κύτταρα E. coli. Η ανασυνδυασμένη καταλυτική υπομονάδα MgCK2α ήταν λειτουργική και ικανή να φωσφορυλιώνει την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΜgΡ1 του ριβοσωμικού μίσχου, αλλά και την ρυθμιστική ΜgCK2β υπομονάδα, όπως δείχθηκε με δοκιμασία κινάσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, τόσο οι ριβοσωμικές Ρ-πρωτεΐνες, όσο και η πρωτεϊνική κινάση MgCK2 και οι υπομονάδες της μελετήθηκαν και απομονώθηκαν για πρώτη φορά σε θαλάσσια ασπόνδυλα, και ειδικότερα στο μύδι Μ. galloprovincialis.Ο ριβοσωμικός μίσχος ρυθμίζει, ως γνωστόν, την ενεργότητα των ριβοσωμάτων, και η απομόνωση και περαιτέρω μελέτη του ενζύμου CK2 που φωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες του θα συμβάλλει στη γνώση μας για το ρόλο του στη μεταφραστική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε φυσιολογικές συνθήκες αλλά και σε συνθήκες καταπόνησης (στρες). Ακόμη, σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα, τόσο η ριβοσωμική πρωτεΐνη Ρ0, όσο και η SOD και η κινάση CK2 του Μ. galloprovincialis είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες θαλάσσιας ρύπανσης.