Μεταγωγή του σήματος του TGFβ/ακτιβίνης Α και πρώιμα ενδοσώματα: ο ρόλος της πρωτεΐνης SARA

Abstract

Members of the TGFβ/Activin A family transduce their signals via serine/threonine transmembrane receptors type I and II. Constitutively active type II receptors phosphorylate type I receptors, which in turn activate RSMADs (SMAD2 and SMAD3) at their C-terminal SSXS motifs. The R-Smads, in turn, oligomerize with the common partner SMAD4 and translocate to the nucleus where they bind to the promoters of a large variety of target genes and regulate their expression in a positive or negative manner. SARA (SMAD Anchor for Receptor Activation) plays an important role in this process, recruiting SMAD2/3 to the vicinity of the receptor for phosphorylation. SARA harbours a FYVE domain (Fab1, YOTB/ZK632.12, Vac1, και EEA1), which targets the protein to the endocytic compartment via binding to PI(3)P, which is enriched in the early endosome. In the present study, using yeast-two hybrid system, we identified ERBIN (ERBB2 Interacting Protein) as a novel SARA interacting protein. The interaction was confirmed using biochemical approaches, such as GST pull down assays, immunoprecipitation experiments and sucrose flotation experiments. Moreover, using confocal microscopy, we found that overexpression of GFP-SARA recruits ERBIN to the early endocytic compartment. To define the domains of SARA and ERBIN responsible for the interaction, we generated a series of deletion mutants of both proteins and tested their interaction. To this end, we found that SARA interacts with ERBIN via a domain, which we called ERBID (ERBIN Binding Domain). ERBIN associated with SARA via a 57 aa domain. ERBIN was recently shown to bind and segregate phosphorylated SMAD2/3 in the cytoplasm, thereby inhibiting SMAD2/3-dependent transcription. We further mapped the domain of ERBIN, which interacted with SMAD2/3 and found that SMAD2/3 and SARA bind to the same domain of ERBIN, an area we called SSID (SARA and SMAD Interacting Domain). Moreover, we found that ERBIN interacts with non-phosphorylated and phosphorylated SMAD2/3 proteins. Thus, ERBIN may retain phosphorylated SMAD2/3 in the cytoplasm inhibiting the translocation to the nucleus and regulating transcription of target genes. Due to the fact that SARA and SMAD2/3 bind to the same domain of ERBIN, we addressed whether this binding was competitive. We showed that SARA and SMAD2/3 compete with each other for their binding to the SSID domain of ERBIN. In accordance, SARA or ERBID overexpression, reverts the inhibitory effect of ERBIN on SMAD2/3 dependent translation. In conclusion, we have identified ERBIN as a novel SARA-interacting protein that can be recruited by the latter to early endosomes, where SARA predominantly resides. SARA binds to ERBIN using a novel domain, which we have called ERBID. ERBIN interacts with SARA via a domain that interacts also with SMAD2 and SMAD3 (aa 1208-1265, SSID). As a consequence, SARA competes with SMAD2/3 for binding to ERBIN. As ERBIN binds and segregates phosphorylated SMAD2/3 in the cytoplasm, thereby inhibiting SMAD2/3-dependent transcription, over-expression of SARA or ERBID reverses the inhibitory effect of ERBIN on SMAD2/3-dependent transcription. Thus, SARA not only ensures proper presentation of SMAD2/3 for phosphorylation by TGFβ/Activιν A receptors, but also facilitates the nuclear transfer of phosphorylated SMAD2/3 by out-competing their cytoplasmic segregation by ERBIN. Our data suggest that the response of cells to TGFβ/Activin A might be regulated by a complex interplay between the relative concentrations of SARA, ERBIN, and SMAD2/3, as well as their binding affinities.

Μέλη της οικογένειας TGFβ/Ακτιβίνης Α μετάγουν σήματα μέσω διαμεμβρανικών υποδοχέων τύπου Ι και ΙΙ με ενεργότητα σερίνης/θρεονίνης. Ο συνεχώς ενεργός υποδοχέας τύπου II φωσφορυλιώνει τον τύπου Ι υποδοχέα ο οποίος στη συνέχεια ενεργοποιεί τους διαμεσολαβητές SMAD2 και SMAD3. Οι τελευταίοι συνδέονται με τη SMAD4 και το σύμπλοκο που δημιουργείται μετατοπίζεται στο πυρήνα του κυττάρου όπου ρυθμίζει τη μεταγραφή γονιδίων στόχων. Η πρωτεΐνη SARA (SMAD Anchor for Receptor Activation) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αυτή αφού στρατολογεί και παρουσιάζει τη SMAD2 και τη SMAD3 στους τύπου Ι υποδοχείς για φωσφορυλίωση. Η SARA όχι μόνο εντοπίζεται στα πρώιμα ενδοσώματα, αλλά και η περιοχή FYVE (Fab1, ΥΟΤΒ/ΖΚ632.12, Vac1, και ΕΕΑ1), μέσω της σύνδεσης της με το λιπίδιο ΡΙ(3)Ρ που είναι εμπλουτισμένο στο διαμέρισμα αυτό, είναι αρκετή για τη στόχευσή της στις μεμβράνες των ενσωμάτων. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιώντας το σύστημα δύο υβριδίων, ταυτοποιήσαμε την ERBIN (ERBB2 interacting Protein) ως μια πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με τη SARA. Η αλληλεπίδραση αυτή επιβεβαιώθηκε με βιοχημικές τεχνικές, όπως δοκιμασίες καταβύθισης, πειράματα ανοσοκατακρήμνισης και επίπλευση μεμβρανικών κλασμάτων σε βαθμίδωση σουκρόζης. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση της GFP-SARA είναι ικανή να στρατολογήσει την ERBIN στα πρώιμα ενδοσώματα, αφού οδήγησε σε σημαντικό βαθμό συνεντοπισμού μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, εστιάσαμε την προσοχή μας στη μοριακή χαρτογράφηση, δηλαδή στην ανεύρεση των ελάχιστων πρωτεϊνικών περιοχών που είναι υπεύθυνες για την αλληλεπίδραση. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήσαμε αλληλεπικαλυπτόμενες πλασμιδιακές κατασκευές που χρησιμοποιήθηκαν σε μια σειρά πειραμάτων καταβύθισης από τα οποία προκύπτει ότι η πρωτεΐνη SARA αλληλεπιδρά με την ERBIN χρησιμοποιώντας μια περιοχή, την οποία την ονομάσαμε ERBID (ERBIN Binding Domain) και η οποία για πρώτη φορά ταυτοποιείται να αλληλεπιδρά με τη SARA. Από την άλλη πλευρά, η πρωτεΐνη ERBIN συνδέεται με τη SARA μέσω της ίδιας περιοχής (aa 1208-1265) με την οποία αλληλεπιδρούν επίσης οι R-SMADs (SMAD2 και SMAD3). Την παραπάνω περιοχή την ονομάσαμε SSID (SARA and SMAD Interacting Domain). Επιπλέον, διαλευκάναμε ότι η ERBIN μπορεί να αλληλεπιδρά όχι μόνο με τις μη-φωσφορυλιωμένες, αλλά και με τις φωσφορυλιωμένες μορφές των SMAD2/3 πρωτεϊνών, μορφές με τις οποίες δεν αλληλεπιδρά η SARA. Έτσι, η ERBIN είναι σε θέση να κατακρατεί τις φωσφορυλιωμένες SMAD2/3 στο κυτταρόπλασμα αναστέλλοντας τη μετακίνηση τους στον πυρήνα και τη ρύθμιση της μεταγραφής των γονιδίων στόχων. Με βάση το γεγονός ότι η SARA και οι SΜAD2/3 δεσμεύονται στην ίδια περιοχή της ERBIN, διερευνήσαμε αν αυτή η σύνδεση είναι ανταγωνιστική. Δείξαμε λοιπόν, ότι οι SMAD2/3 πρωτεΐνες και η SARA, που αλληλεπιδρούν με την ERBIN ανεξάρτητα η μια από την άλλη, ανταγωνίζονται μεταξύ τους για την πρόσδεση στην περιοχή SSID της ERBIN. Σε συμφωνία, η υπερέκφραση της SARA ή του πολυπεπτιδίου ERBID αντιστρέφει την ανασταλτική επίδραση της ERBIN στην από τις πρωτεΐνες SMAD2/3-εξαρτώμενη μεταγραφή. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνουν ότι η SARA, έκτος από την παρουσίαση των SMAD2/3 για φωσφορυλίωση από τους υποδοχείς του TGFβ ή της Ακτιβίνης Α, διευκολύνει επίσης τη μετακίνηση των φωσφορυλιωμένων SΜAD2/3 στον πυρήνα δρώντας ανταγωνιστικά ως προς την κατακράτηση στο κυτταρόπλασμα των φωσφορυλιωμένων SMAD2/3 πρωτεϊνών που προκαλεί η παρουσία της ERBIN. Φαίνεται, λοιπόν, ότι η απόκριση των κυττάρων στον TGFβ ή την Ακτιβίνη Α μπορεί να ρυθμίζεται από μια πολύπλοκη διασύνδεση που εξαρτάται από τις σχετικές συγκεντρώσεις της SARA, της ERBIN και των SMAD2/3 πρωτεϊνών, καθώς επίσης και των σταθερών διάστασης των αλληλεπιδράσεών τους.