Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και των γονιδιακών οδών με cDNA μικροσυστοιχίες κατά τη διάγνωση και τη χημειοθεραπεία στην παιδική οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία

Abstract

Introduction: Hitherto, even though cure rates in childhood Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) reach 80% a subset of pediatric patients still relapse, exhibiting inferior prognosis. Consequently, emphasis could be placed on accurate identification of drug-resistant cases, elucidation of mechanisms underlying drug resistance and development of novel therapeutic strategies. Pharmacodynamic and pharmacogenomic studies are still carried out, even in well known drugs, to provide rational criteria for individualized therapy, enhanced efficacy and reduced toxicity. Aim & Objectives: This study was undertaken to develop a model system in order to investigate the effect of chemotherapy factors employed in childhood ALL therapy. Certain objectives included the study of: 1) Cell growth, apoptosis and necrosis under the effect of these drugs and 2) Gene expression profile (GEP) of treated cells in relation to cells’ nature and each drug’s dose. Materials and Methods: CCRF-CEM (T-leukemic cells) and CCRF-SB (B-leukemic cells) cell lines were used. A model system was created by treating cells with Prednisolone, Vincristine, L-Asparaginase, Daunomycin/Doxorubicin, Aracytine, Cyclophosphamide and Methotrexate, as those drugs are included in the induction phase of ALL treatment. Cell growth, cycle, necrosis and apoptosis were studied using flow cytometry, whilst gene differential expression was determined by microarrays. Microarray data analyses were statistically performed using Matlab simulation environment. The differentially expressed genes were identified with Gene Ontology Database. Results: The CCRF-CEM cells exhibited a biphasic reaction to prednisolone; with induction of mitosis following the application of small doses and necrosis after higher. The cell line proved to be resistant to Prednisolone. The differentially expressed genes that were determined included RTN4R, NEFL, CHEK1, SYCE1L, ITIH, B3GAT3, TTC3, RTN4R, CYP1A1 and HOXA13, which have been generally associated with neural development, regulation of neuronal axon’ construction, cell cycle functions, metabolism of glucosamine/glycanes, negative regulation of cell growth as well as activation of catabolism and recycling of proteins. The differentially expressed genes between the two cell lines treated with prednisolone, included FICD, PREX, LIAS, TPK, which take part in the regulation of the Rho proteins signalling pathway and the regulation of biosynthetic co-enzymes. The CCRF-CEM cells proved to be sensitive to Vincristine. The differentially expressed genes identified were NEFL, SHARPIN, RTN4R, UBB, HTT, MBP and ACSBG1, which have been related to the regulation of cell death and neuronal development functions. Cell proliferation was terminated following treatment with Doxorubicin/Daunomycin. The microarray study revealed the SLC12A8, SEC61G, SLC26A4, TRPM5Τ, NEFL, TIAM2, FANCA, LFNG genes that take part in transmembrane transportation, regulation of cell death and M phase in the meiotic cycle. The CCRF-CEM cells also proved to be sensitive to Aracytine. The differentially expressed genes FICD, TIAM2, NDUFS1, ATB2B4 detected following application of microarrays were dose dependent to the drug. All have been related to the Rho proteins signalling pathway and the biosynthesis and metabolism of nucleotides. Other differentially expressed genes including MYT1L, IRX6 and TBX1 were found to be involved in the regulation of RNA metabolism. Interestingly, CCRF-CEM cells proved to be resistant to Methotrexate. The differentially expressed genes identified from the microarray study were KLK6, MBP, RTN4R, NEFL, CHEK1 and CAMK2G, which normally participate in the regulation activities of the central nervous system and protein phosphorylation. Common genes that were differentially expressed between the two cell lines following treatment with Aracytine were SOS2, FICD, TIAM2, PREX1, SPATA13, ADAM9 and ADORA1. These genes were related to the Rho proteins signalling pathway and the MAPK signalling pathway. Further differentially expressed genes that were detected between these two cell lines and in correlation with anthracyclines’ treatment included ATF6, IKZF2, PRKDC, HDAC2 and TFEB, which are encoding proteins that participate in the transcription process. Following methotrexate treatment the differentially expressed genes were related to the MAPK signalling pathway. Accordingly, during the performance of vincristine experiments, the differentially expressed genes were related to cell death, calcium channels and neuronal morphogenesis. Conclusions: The over expression or down-regulation of certain genes suggested that the aforementioned mechanisms or functions are activated or deactivated in leukemic cells as a reaction to these drugs. These gene expression alterations could explain the cells’ resistance or sensitivity to treatment. The identified genes could potentially represent prognostic factors or therapeutic targets. In general, the application of the above model might lead to individualized therapeutic interventions to increase drug efficacy and reduce toxicity.

Εισαγωγή: Η Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία (ΟΛΛ) της παιδικής ηλικίας παρουσιάζει αυξανόμενο ποσοστό επιβίωσης τα τελευταία χρόνια. Ωστόσο οι μέθοδοι κατάταξης ως προς τους παράγοντες κινδύνου της νόσου που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα, δικαιολογούν μικρό ποσοστό από τους ασθενείς που τελικά υποτροπιάζουν. Γίνεται προσπάθεια στην καλύτερη αξιοποίηση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων που ήδη υπάρχουν, με περαιτέρω μελέτη του τρόπου δράσης τους. Σκοπός: Να δημιουργηθεί ένα κυτταρικό σύστημα μελέτης στο οποίο να μελετηθεί η επίδραση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της ΟΛΛ στην παιδική ηλικία. Να μελετηθεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αυτών, η απόπτωση και η νέκρωσή τους κάτω από την επίδραση των φαρμάκων. Να μελετηθεί η έκφραση των γονιδίων κατά την επώαση με τα φάρμακα και να εντοπισθούν μεταβολές που οφείλονται στη φύση των κυττάρων, στη φύση του κάθε φαρμάκου και τη δόση που χρησιμοποιήθηκε και να βρεθούν πιθανοί προγνωστικοί και θεραπευτικοί στόχοι. Υλικό και μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές CCRF-CEM (Τ-λευχαιμικά κύτταρα) και CCRF-SB (Β-λευχαιμικά κύτταρα). Τα κύτταρα επωάσθηκαν με τα φάρμακα Prednisolone, Vincristine, LAsparaginase, Daunomycin/Doxorubicin, Aracytine, Cyclophosphamide, Methotrexate. Ελέγχθηκε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, ο κυτταρικός κύκλος, ο κυτταρικός θάνατος των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Η διαφορική έκφραση των γονιδίων μελετήθηκε με cDNA μικροσυστοιχίες. Αποτελέσματα: Η Prednisolone έδειξε διφασική δράση στην επίδρασή της στα κύτταρα CCRF-CEM, με μιτογενή δραστηριότητα στις μικρές συγκεντρώσεις και επαγωγή της νέκρωσης στις υψηλές δόσεις. Οι κυτταρικές σειρές ήταν ανθεκτικές στα γλυκοκορτικοειδή. Τα διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια ήταν RTN4R, NEFL, CHEK1, SYCE1L, ITIH3, B3GAT3, TTC3, RTN4R, CYP1A1 και HOXA13, που σχετίζονται με λειτουργίες νευρικής διαφοροποίησης και ρύθμισης της δημιουργίας των αξονίων των νευρώνων, λειτουργίες σχετικές με τον κυτταρικό κύκλο, το μεταβολισμό των γλυκοσαμινών/γλυκανών, την αρνητική ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, και την ενεργοποίηση του καταβολισμού και ανακύκλωσης πρωτεϊνών μέσω του ενδοπλασματικού συμπλέγματος. Στη σύγκριση των δύο κυτταρικών σειρών που επωάσθηκαν με prednisolone βρέθηκαν τα γονίδια FICD, PREX1, LIAS και TPK1 που συμμετέχουν στη ρύθμιση της σηματοδοτικής οδού των Rho πρωτεϊνών και την ρύθμιση βιοσυνθετικών συν-ενζύμων. Τα κύτταρα CCRF-CEM ήταν ευαίσθητα στη Vincristine. Τα διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια ήταν τα NEFL, SHARPIN, RTN4R, UBB, HTT, MBP και ACSBG1, που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και σε λειτουργίες νευρωνικής ανάπτυξης. Η Doxorubicin/Daunomycin επέφερε πλήρη αναστολή του πολλαπλασιασμού στα κύτταρα CCRF-CEM. Στη μελέτη με τις μικροσυστοιχίες βρέθηκαν γονίδια, τα SLC12A8, SEC61G, SLC26A4, TRPM5Τ, NEFL TIAM2, FANCA και LFNG τα οποία συμμετέχουν σε μηχανισμούς διαμεμβρανικής μεταφοράς, στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και τη ρύθμιση της Μ φάσης στον μειωτικό κυτταρικό κύκλο. Τα κύτταρα CCRF-CEM ήταν ευαίσθητα στην Aracytine. Οι μικροσυστοιχίες έδειξαν διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια τα οποία δρουν δοσοεξαρτώμενα και αφορούν στη δράση της Aracytine. Αυτά τα γονίδια ήταν τα FICD, TIAM2, NDUFS1 και ATB2B4 που συσχετίζονται με τη ρύθμιση της σηματοδοτικής οδού των Rho πρωτεϊνών και συμμετέχουν στη βιοσυνθετική και μεταβολική οδό των νουκλεοτιδίων όπως και τα MYT1L, IRX6 και TBX1 που συμμετέχουν στη ρύθμιση του μεταβολισμού του RNA. Τα κύτταρα CCRF-CEM έδειξαν ανθεκτικότητα στη Methotrexate. Στη μελέτη της methotrexate με μικροσυστοιχίες παρουσιάστηκαν γονίδια που μεταβάλεται η έκφρασή τους. Τα γονίδια αυτά ήταν τα KLK6, MBP, RTN4R, NEFL, CHEK1 και CAMK2G, που συμμετέχουν σε λειτουργίες ρύθμισης του κεντρικού νευρικού συστήματος, διεργασίες του ΚΝΣ και τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών. Κοινά γονίδια στη σύγκριση των σειρών CCRF-CEM και CCRF-SB μετά από επώαση με AraC, ήταν τα γονίδια SOS2, FICD, TIAM2, PREX, SPATA13, ADAM9 και ADORA1, που σχετίζονται με τη ρύθμιση των Rho πρωτεϊνών και τη σηματοδοτική οδό MAPK. Για την επώαση με τις ανθρακυκλίνες τα γονίδια που εμφανίσθηκαν εκφράζουν πρωτεΐνες που έχουν σχέση με μεταγραφικούς παράγοντες ή είναι μεταγραφικοί παράγοντες, όπως τα ATF6, IKZF2, PRKDC, HDAC2 και TFEB. Για την περίπτωση της Methotrexate, τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικώς σχετίζονται επίσης με τη σηματοδοτική οδό MAPK. Στη vincristine ξεχωρίζουν λειτουργίες που σχετίζονται με τον κυτταρικό θάνατο, με τους διαύλους ασβεστίου και την νευρωνική μορφογένεση. Συμπέρασμα: Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της παιδικής ΟΛΛ μελετήθηκαν για τη δράση τους. Προέκυψαν στοιχεία για την κυτταροτοξικότητά τους και για την επίδρασή τους σε συγκεκριμένα γονίδια. Η ενεργοποίηση ή αδρανοποίηση των γονιδίων αυτών υποδεικνύει μηχανισμούς και λειτουργίες που συμμετέχουν στην αντίδραση των λευχαιμικών κυττάρων στα φάρμακα, την ευαισθησία ή την αντοχή τους. Τα γονίδια αυτά θα μπορούσαν να αποτελέσουν προγνωστικούς παράγοντες ή θεραπευτικούς στόχους. Τέλος, η εφαρμογή του μοντέλου που δημιουργήθηκε θα μπορούσε να δώσει στοιχεία για την ευαισθησία ασθενών σε φάρμακα και να τροποποιήσει έτσι το θεραπευτικό σχήμα, αυξάνοντας τις πιθανότητες επιτυχούς θεραπείας με τις λιγότερες παρενέργειες και πιθανότητες υποτροπής.