Μοριακή προσέγγιση στη μελέτη του καρκινικού στρώματος

Abstract

Prostate, breast, and probably other epithelial tumors harbor inactivating mutations in the p53 tumor suppressor gene in the stromal cells, implying the nonautonomous action of p53 in carcinogenesis. We have tested this hypothesis by evaluating the tumorigenicity of MCF7 human breast cancer cells in severe combined immunodeficient mice that differ in their p53 status. Our results showed that, indeed, p53 ablation in the hosts reduced the latency for the development of MCF7 tumors. Furthermore, we show that heterozygous hosts frequently undergo loss of heterozygosity at the p53 locus in the tumor stroma tissue by mechanism that resembles the inactivation of p53 in primary tumors. To evaluate the impact of p53 ablation in the stromal fibroblasts, in tumorigenesis, tumors were reconstituted in mice bearing wild-type p53alleles, by mixing MCF7 cells with fibroblasts isolated from mutant or wild-type p53 mice. Our results suggest that tumors containing p53-deficient fibroblasts developed faster and were more aggressive than their counterparts with wild-type fibroblasts, although their neoplastic component, namely MCF7 mammary carcinoma cells, was identical in both cases. These data strongly support the notion for the operation of a nonautonomous mechanism for p53 action in primary tumors and provide a mechanistic association between p53 mutations in the stromal component of epithelial tumors and carcinogenesis. During carcinogenesis, stromal fibroblasts undergo certain changes in concert with their neoplastic neighbors,an interaction that progressively leads to a cancer-associated state. However, despite the increasing appreciation of the importance of stromal/tumor interactions in the progression of cancer, little is known about the factors responsible for regulating the crosstalk between stromal fibroblasts and neoplastic cells. Here we show that the stage of the disease in primary human breast lesions affects p21 expression in the fibroblasts. In stromal fibroblasts of benign fibroadenomas, p21 exhibits a periductal pattern of staining, which is abolished in malignant adenocarcinomas in which p21 immunopositivity exhibits a mosaic pattern that eventually is abolished in more aggressive types of the disease. In order to address the role of fibroblasts’ p21 in tumorigenesis, we have reconstituted MCF7 human breast cancers in mice, with fibroblasts differingin the p21 status. These experiments showed that p21 deficiency in stromal fibroblasts accelerates tumor growth through cell non-autonomous mechanism(s). In addition, even a transient, siRNA-mediated p21 suppression in fibroblasts sufficiently stimulates MCF7 and MDA-MB-231 growth in vivo. We propose that p21 regulation is intimately linked with the ability of stromal cells to affect tumor growth.

Ο καρκίνος του προστάτη, του μαστού και πιθανόν άλλοι επιθηλιακοί όγκοι περιέχουν απενεργοποιητικές μεταλλαγές για το p53 ογκοκατασταλτικό γονίδιο στα κύτταρα του στρώματος, υποδηλώνοντας την μη-αυτόνομη δράση του p53 στην καρκινογένεση. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε η συγκεκριμένη υπόθεση, αξιολογώντας την ογκογόνο δράση των MCF7 ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων μαστού σε ισχυρά ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια τα οποία διέφεραν ως προς το p53 γονότυπο. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μειωμένη έκφραση του p53 στους ξενιστές μειώνει την διάρκεια της πρώτης φάσης (προσαρμογής) στην ανάπτυξη MCF7 όγκων. Επιπλέον, οι ετερόζυγοι ξενιστές συχνά υφίστανται στο καρκινικό στρώμα απώλεια ετεροζυγωτίας στον γενετικό τόπο p53 με ένα μηχανισμό που ομοιάζει με την απενεργοποίηση του p53 σε πρωτοπαθείς όγκους. Προκειμένου να εκτιμηθεί η επίδραση της καταστολής του p53 των ινοβλαστών του στρώματος στην καρκινογένεση, ανασυγκροτήθηκαν σε φυσιολογικά ποντίκια χιμαιρικοί όγκοι από MCF7 και ινοβλάστες ποντικού οι οποίοι είχαν φυσιολογικό ή μεταλλαγμένο γονότυπο για το p53. Οι όγκοι που προήλθαν από ινοβλάστες με ελλειματικό p53 γονότυπο αναπτύχθηκαν ταχύτερα και ήταν περισσότερο επιθετικοί σε σχέση με τους αντίστοιχους που περιείχαν ινοβλάστες άγριου τύπου, παρόλο που το νεοπλασματικό συστατικό ήταν ταυτόσημο και στις δύο περιπτώσεις (.MCF7). Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα συνηγορούν υπέρ της λειτουργίας ενός μη-αυτόνομου μηχανισμού δράσης του p53 γονιδίου σε πρωτοπαθείς όγκους και παρέχουν μια μηχανιστική σύνδεση ανάμεσα στις p53 μεταλλαγές στο καρκινικό στρώμα επιθηλιακών όγκων και την καρκινογένεση. Κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, οι ινοβλάστες του στρώματος υπόκεινται σε ορισμένες μεταβολές σε συνενόηση με τους νεοπλασματικούς γείτονες, μία αλληλεπίδραση που προοδευτικά τους οδηγεί σε μία σχετιζόμενη με τον καρκίνο κατάσταση. Όμως, παρόλο την διαρκώς αυξανόμενη σημασία που αποδίδεται στις αλληλεπιδράσεις στρώματος και καρκινικού όγκου για την εξέλιξη του καρκίνου, λίγα είναι γνωστά για τους παράγοντες που ρυθμίζουν την συνομιλία ανάμεσα στους ινοβλάστες του στρώματος και τα νεοπλασματικά κύτταρα. Στην παρούσα εργασία δείχνουμε ότι, το στάδιο της ασθένειας σε δείγματα άνθρώπινου πρωτοπαθούς καρκίνου του μαστού επηρεάζει την έκφραση του p21 στους ινοβλάστες. Ειδικότερα, στους στρωματικούς ινοβλάστες καλοήθων ινοαδενωμάτων, ο ανοσοιστοχημικός εντοπισμός της p21 εμφανίζει ένα χαρακτηριστικό πρότυπο ανάπτυξης κοντά στους αγωγούς του καρκινικού επιθηλίου. Αντίθετα στα κακοήθη αδενοκαρκινώματα η χρώση για το p21 παρουσιάζει ένα μωσαικό πρότυπο το οποίο όμως καταργείται στους περισσότερο επιθετικούς τύπους της ασθένειας. Προκειμένου να αξιολογήσουμε το ρόλο του p21 των ινοβλαστών στην καρκινογένεση, προχωρήσαμε σε ανασύσταση χιμαιρικών όγκων από MCF7 και εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικού οι οποίοι διέφεραν στον p21 γονότυπο. Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι η απουσία του p21 στους στρωματικούς ινοβλάστες επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου μέσω κυτταρικών μη-αυτόνομων μηχανισμών. Επιπλέον αξίζει να σημειωθεί ότι ακόμα και μια παροδική καταστολή της έκφρασης του p21 στους ινοβλάστες με την τεχνολογία siRNA είναι αρκετή για να αυξήσει την ανάπτυξη των καρκινικών σειρών MCF7 και MDA-MB-231 in vivo. Επομένως προτείνουμε ότι η ρύθμιση της p21 είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την ικανότητα του στρώματος να επηρεάζει την αύξηση ενός όγκου.