Κλινική αξιολόγηση και μελέτη της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης και του νέου αποπτωτικού γονιδίου BCL2L12 στο γαστρικό καρκίνο

Abstract

Gastric cancer belongs among the most lethal malignant neoplasms, with its frequency to exhibit wide geographical distribution, worldwide. Stomach tumours of the first stages are often asymptomatic, fact which delays their early diagnosis. Consequently, by the time of their diagnosis, locally advanced or metastatic tumours are practically inoperable, thus rendering patients’ cure not feasible. Despite the identification of a number of possible cancer biomarkers, their overall utility in stomach cancer remains fragmentary. Although the percentage of patients’ survival, with gastric tumours, has escalated, high mortality levels still predominate. Therefore, the discovery of new molecular indicators for the early diagnosis, prognosis and prediction of response to therapeutic treatment, in gastric cancer, is of exquisite importance. After intensive research studies, it has become evident that deregulation of apoptosis exerts a drastic role in the development or progression of various human malignancies. The apoptotic genes seem to be involved in the transformation of normal gastric epithelium to the corresponding with α malignant phenotype. Relatively recent was the identification and cloning by Scorilas et al., of the BCL2L12 (BCL2-like 12) gene, which belongs to the BCL-2 apoptotic genes’ family. The BCL2L12 gene has been localized at the chromosomal locus 19q13.3, at a close proximity to the already known genes IRF3 and RRAS that are related to carcinogenesis. Except for the classical transcript of the BCL2L12 gene, two additional alternative transcripts have been described, the BCL2L12-A lacking exon 3 and one isoform which possesses three nucleotides less than the classical transcript. The mRNA expression levels of BCL2L12 have been studied in the human malignancies of the breast, colon and glioblastoma. Important modulations in the mRNA expression of the gene have been noticed in a variety of cancer cell lines following their exposure to several cytotoxic drugs. The DDC gene maps to the chromosomal region 7p12.2 and codes for the enzyme L-Dopa decarboxylase which participates, mainly, in the decarboxylation of L-3,4 dihydroxy-phenylalanine (L-Dopa) to dopamine. Up to date, four different transcripts of the gene have been identified, which constitute products of alternative splicing events: one ‘‘neural-type’’, a second one of ‘‘non-neural type’’, one transcript lacking exon 3 and the Alt-DDC mRNA that includes an alternative exon 10. Enhanced mRNA expression of the DDC gene, as well as, elevated activity of the enzyme have been observed in tumours of neuroendocrine origin. In the case of solid tumours, such as colon and prostate carcinomas, DDC mRNA overexpression has been associated with the diagnosis and the prognosis of these types of cancer. High DDC mRNA levels have been detected in gastric cancer cells’ micrometastases to the peritoneal cavity. In the present PhD thesis, the genes BCL2L12 and DDC were studied and clinically evaluated in primary tumours of the stomach. Furthermore, their utility as possible tumour markers for the early prognosis and accurate staging of the disease, as well as, for the prediction of patients’ response to the selection of the appropriate chemotherapeutic treatment, was investigated. Particularly, in parallel with the collection of the 80 gastric tissue specimens, the construction of a detailed database was performed, which included each patient’s full medical history for an extensive subsequent biostatistical analysis. An outline of the experimental processes regarded tissue homogenization of a statistically significant sample size of the collected tissue specimens, total RNA isolation and cDNA synthesis. The mRNA expression of the genes BCL2L12 and DDC was examined, qualitatively, with regular-PCR, while for their quantification, qReal-time PCR methodology was developed by exploiting the SYBR Green I chemical detection system. Having isolated total protein and having determined its concentration with the Bradford assay, analysis and study of the full-length DDC protein, with Western immunoblotting, was conducted in gastric tissue samples. Additionally, the activity of the DDC enzyme was also explored towards the decarboxylation of L-Dopa to dopamine. The effect of the cytotoxic substances doxorubicin, epirubicin, oxaliplatin and methotrexate on the viability of the cancer cell line, AGS, from stomach adenocarcinoma was looked at with the MTT assay. Afterwards, BCL2L12 and DDC mRNA expression was qualitatively analyzed (with regular-PCR) and quantitatively determined (with qReal-time PCR) in the treated-AGS cells compared with the control-cells of each corresponding time interval. The results from the qualitative analysis illustrated differences in the mRNA expression of the two target-genes both in cancerous and in non-cancerous (normal) gastric tissue samples. Following the statistical analysis of the data obtained from real-time polymerase chain reaction methodology, significantly elevated BCL2L12 expression was found in the stomach adenocarcinomas of the early TNM stages and also in those tumours histologically categorized as intestinal-type. Correlation of the expression of the DDC gene with the clinicopathological features of the patients revealed statistically significant increased mRNA levels of the gene in stomach carcinomas of the intestinal histological type and in those neoplasms located at the lower third part of the stomach. Kaplan Meier survival analyses demonstrated that patients with gastric tumours, in which the expression of the genes BCL2L12 and DDC was increased and above the cutoff point, displayed better overall survival and experienced lower risk for recurrences as opposed to patients whose neoplasms did not express these particular genes. Therefore, we propose the possible use of BCL2L12 and DDC as independent and favourable prognostic indicators with a statistically significant strenght for the disease free survival (DFS) and the overall survival (OS) of gastric cancer patients. Although, small fluctuations of the DDC protein levels were documented between the cancerous stomach specimens, the enzyme did not seem to be active towards the decarboxylation of L-Dopa to dopamine. The study of the molecular changes, at the mRNA level, of the genes BCL2L12 and DDC in the gastric cancer cell line AGS, disclosed remarkable alterations after cells’ incubation with the prementioned anticancer drugs. These particular findings showed that, on their majority, the levels of these two genes were significantly diminished following the addition of one of the four antineoplastic substances in the AGS cells in comparison to the untreated control cells (without drug). The declining tendency, viewed at the mRNA levels of BCL2L12 and DDC, particularly when either epirubicin or oxaliplatin was present, respectively, seemed to be also time-dependent. Our overall data highlight the importance of BCL2L12 and DDC genes as emerging, future markers capable of predicting, staging and monitoring gastric cancer patients’ response to a more effective therapeutic treatment against gastric cancer. Part of the results of the present PhD Thesis has been published on the international research journal with reviewers ‘‘Biochemical and Biophysical Research Communications’’. [Florou D, Papadopoulos IN, Scorilas A. Biochem Biophys Res Commun. 010;391(1):214-8].

Ο γαστρικός καρκίνος ανήκει στα πιο θανατηφόρα κακοήθη νεοπλάσματα με τη συχνότητά του να εμφανίζει ευρεία γεωγραφική κατανομή, σε παγκόσμια κλίμακα. Οι όγκοι στομάχου των πρώτων σταδίων είναι συχνά ασυμπτωματικοί, γεγονός που καθυστερεί την έγκαιρη διάγνωσή τους. Συνεπώς, τη στιγμή της διάγνωσής τους, τοπικά προχωρημένοι ή μεταστατικοί όγκοι είναι πρακτικά ανεγχείρητοι, καθιστώντας έτσι ακατόρθωτη τη θεραπεία των ασθενών. Παρά την αναγνώριση ενός αριθμού πιθανών καρκινικών βιοδεικτών, η χρησιμότητά τους, συνολικά, στον καρκίνο του στομάχου παραμένει ακόμα τμηματική. Μολονότι έχει αυξηθεί το ποσοστό επιβίωσης ασθενών με καρκίνο στομάχου, η θνησιμότητα εξακολουθεί να βρίσκεται σε υψηλά επίπεδα. Επομένως, είναι εξαιρετικής σπουδαιότητας η ανεύρεση νέων μοριακών καρκινικών δεικτών για την έγκαιρη διάγνωση, πρόγνωση και πρόβλεψη ανταπόκρισης στη θεραπευτική αγωγή στο γαστρικό καρκίνο. Μετά από εντατικές ερευνητικές μελέτες, καθίσταται εμφανές ότι η απορρύθμιση της απόπτωσης διαδραμματίζει σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση ή την εξέλιξη διαφόρων νεοπλασιών στον άνθρωπο. Τα αποπτωτικά γονίδια φαίνεται να εμπλέκονται στο μετασχηματισμό του φυσιολογικού γαστρικού επιθηλίου σε αντίστοιχο με κακόηθες φαινότυπο. Σχετικά πρόσφατα έχει ανακαλυφθεί και κλωνοποιηθεί από τους Scorilas et al., το γονίδιο BCL2L12 (BCL2-like 12), το οποίο ανήκει στην οικογένεια BCL-2 των αποπτωτικών γονιδίων. Το γονίδιο BCL2L12 έχει εντοπισθεί στο χρωμοσωμικό τόπο 19q13.3 κοντά στα ήδη γνωστά γονίδια IRF3 και RRAS, τα οποία σχετίζονται με την καρκινογένεση. Εκτός από το κλασσικό μετάγραφο του γονιδίου BCL2L12, έχουν περιγραφεί δύο ακόμα εναλλακτικά μετάγραφα, το BCL2L12-Α που στερείται του τρίτου εξωνίου και μία mRNA ισομορφή με τρία λιγότερα νουκλεοτίδια του κλασσικού μεταγράφου. Τα επίπεδα έκφρασης mRNA του BCL2L12 έχουν μελετηθεί σε ανθρώπινες κακοήθειες όπως του μαστού, του παχέος εντέρου και του γλοιοβλαστώματος. Σημαντικές μεταβολές στην έκφραση mRNA του γονιδίου έχουν παρατηρηθεί σε ποικίλες καρκινικές κυτταρικές σειρές κατόπιν έκθεσής τους σε διάφορα κυτταροστατικά φάρμακα. Το γονίδιο DDC χαρτογραφείται στη χρωμοσωμική περιοχή 7p12.2 και κωδικοποιεί το ένζυμο L-Dopa αποκαρβοξυλάση που συμμετέχει κυρίως στην αποκαρβοξυλίωση της L-3,4 διϋδροξυ-φαινυλαλανίνης (L-Dopa) σε ντοπαμίνη. Έως σήμερα έχουν αναγνωρισθεί τέσσερα διαφορετικά μετάγραφα του γονιδίου που αποτελούν προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος: ένα ‘‘νευρικού τύπου’’, ένα δεύτερο ‘‘μη-νευρικού τύπου’’, ένα μετάγραφο χωρίς το εξώνιο 3 και το Alt-DDC mRNA που περιέχει ένα εναλλακτικό εξώνιο 10. Αυξημένη έκφραση mRNA του γονιδίου DDC και υψηλή ενεργότητα του ενζύμου έχουν παρατηρηθεί σε όγκους νευροενδοκρινούς προέλευσης. Στην περίπτωση συμπαγών όγκων, όπως του παχέος εντέρου και του προστάτη η υπερέκφραση του γονιδίου DDC έχει συσχετισθεί με τη διάγνωση και την πρόγνωση αυτών των μορφών καρκίνου. Αυξημένα επίπεδα mRNA του γονιδίου DDC έχουν ανιχνευθεί σε διάσπαρτους γαστρικούς όγκους στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν και αξιολογήθηκαν κλινικά τα γονίδια BCL2L12 και DDC σε πρωτοπαθείς όγκους του στομάχου. Διερευνήθηκε, επιπλέον, η χρησιμότητά τους ως πιθανοί καρκινικοί δείκτες στην έγκαιρη πρόγνωση και σταδιοποίηση της νόσου καθώς και στην πρόβλεψη της απόκρισης των ασθενών στην επιλογή κατάλληλης χημειοθεραπευτικής αγωγής. Συγκεκριμένα, παράλληλα με τη συλλογή των 80 ιστολογικών γαστρικών δειγμάτων, πραγματοποιήθηκε κατασκευή αναλυτικής βάσης δεδομένων με το πλήρες ιατρικό ιστορικό κάθε ασθενή για τη μετέπειτα εκτενή βιοστατιστική ανάλυση. Οι πειραματικές διαδικασίες περιελάμβαναν αρχικά την ομογενοποίηση του στατιστικά σημαντικού μεγέθους των συλλεγομένων ιστοτεμαχίων, την απομόνωση ολικού RNA και τη σύνθεση cDNA. Η έκφραση mRNA των γονιδίων BCL2L12 και DDC εξετάσθηκε, ποιοτικά, με τη μέθοδο της συμβατικής-PCR, ενώ για την ποσοτικοποίησή τους αναπτύχθηκε μεθοδολογία qReal-time PCR με τη χρήση του συστήματος ανίχνευσης SYBR Green I. Επιπροσθέτως, μετά την απομόνωση ολικής πρωτεΐνης και τον προσδιορισμό της συγκέντρωσή της με τη μέθοδο Bradford, έλαβε χώρα μελέτη έκφρασης της πλήρους-μήκους ισομορφής της πρωτεΐνης DDC σε δείγματα στομάχου με στύπωση Western και ανοσοεντοπισμό, ενώ διερευνήθηκε η ενεργότητα του ενζύμου ως προς το κύριο υπόστρωμά της την L-Dopa. Η επίδραση των κυτταροστατικών ουσιών δοξορουβικίνη, επιρουβικίνη, οξαλιπλατίνη και μεθοτρεξάτη στη βιωσιμότητα της καρκινικής κυτταρικής σειράς, AGS, από αδενοκαρκίνωμα στομάχου εξετάσθηκε με τη δοκιμασία MTT. Κατόπιν αναλύθηκε ποιοτικά (με συμβατική-PCR) και προσδιορίσθηκε ποσοτικά (με Real-time PCR) η έκφραση mRNA των γονιδίων BCL2L12 και DDC στα κύτταρα με φάρμακο σε σύγκριση με τα κύτταρα-μάρτυρες κάθε αντίστοιχου χρονικού διαστήματος. Τα αποτελέσματά ποιοτικής ανάλυσης κατέδειξαν διαφορές στην έκφραση των δύο γονιδίων-στόχων τόσο στα καρκινικά όσο και στα μη-καρκινικά (φυσιολογικά) γαστρικά ιστολογικά δείγματα. Από τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων της μεθοδολογίας της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, βρέθηκε αυξημένη έκφραση, στατιστικά σημαντική, του γονιδίου BCL2L12 σε αδενοκαρκινώματα στομάχου αρχικών TNM σταδίων καθώς και σε όγκους που είχαν κατηγοριοποιηθεί ιστολογικά ως εντερικού-τύπου. Η συσχέτιση της έκφρασης του γονιδίου DDC με τα κλινικοπαθολογικά γνωρίσματα των ασθενών απεκάλυψε στατιστικά σημαντικά αυξημένα επίπεδα mRNA του γονιδίου σε εντερικού-τύπου καρκινώματα στομάχου και σε εκείνους τους όγκους που εντοπίζονται στο κάτω 3/μόριο του στομάχου. Κατά την ανάλυση επιβίωσης Kaplan Meier φάνηκε ότι ασθενείς με γαστρικούς όγκους, όπου η έκφραση των γονιδίων BCL2L12 και DDC ήταν υψηλή και πάνω από το βέλτιστο σημείο λήψης απόφασης (cutoff), παρουσίασαν καλύτερησυνολική επιβίωση και είχαν μικρότερο κίνδυνο για υποτροπές σε αντίθεση με ασθενείς τα νεοπλάσματα των οποίων δεν εξέφραζαν τα συγκεκριμένα γονίδια. Προτείνουμε, επομένως, την πιθανή χρησιμοποίηση των BCL2L12 και DDC ως ανεξάρτητους και ευμενείς προγνωστικούς δείκτες με στατιστικά σημαντική ισχύ στην επιβίωση ελεύθερης νόσου (DFS) και την ολική επιβίωση (OS) των ασθενών με γαστρικό καρκίνο. Παρόλο που η έκφραση της πρωτεΐνης DDC παρουσίασε μικρές διακυμάνσεις μεταξύ των καρκινικών δειγμάτων στομάχου, δε φάνηκε το ένζυμο να είναι ενεργό ως προς την αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa σε ντοπαμίνη. Η μελέτη των μοριακών μεταβολών, σε επίπεδο mRNA, στα γονίδια BCL2L12 και DDC στα καρκινικά κύτταρα στομάχου AGS, απεκάλυψε αξιοσημείωτες αλλαγές κατόπιν επώασης των κυττάρων με τα αντικαρκινικά φάρμακα που προαναφερθήκαν. Τα ευρήματα αυτής της μελέτης, στην πλειονότητά τους, έδειξαν σημαντικά ελαττωμένα επίπεδα της έκφρασης των μελετώμενων γονιδίων κατόπιν προσθήκης μιας εκ των τεσσάρων αντινεοπλασματικών ουσιών στα κύτταρα AGS σε σχέση με τα κύτταρα-μάρτυρες (απουσία φαρμάκου). Η πτωτική τάση που παρατηρείται στα επίπεδα mRNA του BCL2L12 και του γονιδίου DDC παρουσία κυρίως επιρουβικίνης ή οξαλιπλατίνης, αντίστοιχα, φάνηκε να είναι και χρονο-εξαρτώμενη. Αναδεικνύεται από τα ευρήματά μας, συνολικά, η σημασία των γονιδίων BCL2L12 και DDC ως εν δυνάμει μελλοντικοί δείκτες πρόγνωσης, σταδιοποίησης και παρακολούθησης της απόκρισης των ασθενών σε μια πιο αποτελεσματική θεραπευτική αγωγή για την αντιμετώπιση του γαστρικού καρκίνου. Μέρος των αποτελεσμάτων της διδακτορικής διατριβής δημοσιεύθηκαν στο διεθνές επιστημονικό περιοδικό με κριτές «Biochemical and Biophysical Research Communications» [Florou D, Papadopoulos IN, Scorilas A. Biochem Biophys Res Commun. 010;391(1):214-8].