Η ριβονουκλεάση P (RNase P) των ανθρώπινων λεμφοκυττάρων

Abstract

Ribonuclease P (RNase P) is the enzyme responsible for the 5΄maturation of the precursor tRNA molecules, participating in tRNA biogenesis and therefore in protein synthesis. It catalyses the endonucleolytic cleavage of a phosphodiester bond in the presence of Mg²⁺ and results in the production of molecules that bear 3΄hydroxyl and 5΄phosphoric ends. Most forms of RNase P are ribonucleoproteins consisting of an essential RNA and protein subunits. The RNA component of the bacterial RNase P was one of the first identified catalytic RNAs. So far, RNase P and the ribosome are the only ribozymes known to be conserved in all kingdoms of life (bacteria, archaea and eucarya). Eykaryotic RNase P activity has been detected in nuclei, mitochondria and chloroplasts and demonstrates great variability in protein subunit composition. Nuclear RNase P has been purified or partially purified from several eukaryotes, primarily from yeast and human cells. In humans, the nuclear holoenzyme consists of one essential RNA, named H1 and ten protein subunits, which are Rpp14, Rpp20, Rpp21, Rpp25, Rpp29, Rpp30, Rpp38, Rpp40, hPop1 and hPop5. It was recently shown that RNA of human RNase P retains traces of catalytic activity. In view of the vital importance of lymphocytes for an effective immune system, we proceeded to the RNase P isolation from human peripheral lymphocytes. The enzyme was purified with cation exchange phosphocellulose chromatography. RNase P was eluted with a linear gradient of 50-500 mM NH₄Cl. Enzyme assays were carried out using an in vitro labeled transcript of Schizosaccharomyces pombe tRNASer gene SupS1. The products of the enzymatic reaction were resolved on a denaturing polyacrylamide 10%, 8 M urea gel and visualized by phosphorimaging in a Fuji FLA-3000 and quantified by using the AIDA software package. Herein, it was investigated the effect of the synthetic retinoids (cisretinoic acid and acitretin), neomycin B, as well as chloroquine diphosphate, on the RNase P activity. Cis-retinoic acid, acitretin and neomycin B exerted a dose-dependent inhibitory effect on RNase P activity from human lymphocytes, while the activity was not affected in the presence of chloroquine diphosphate. A detailed kinetic analysis showed that the inhibition caused by acitretin was of competitive type, whereas that caused by neomycin B was of noncompetitive type. The kinetic constant Km (245 nM) of RNase P activity isolated from lymphocytes for the tRNA maturation reaction is comparable to that of RNase P isolated from normal human epidermal keratinocytes (Km=233 nM). The difference in Vmax values (0.42 pmol/min for the RNase P from human peripheral lymphocytes compared to 2.4 pmol/min for the normal human epidermal keratinocytes) may be due to different enzyme concentration of the two RNase P preparations used for the kinetic analysis. We cannot exclude the possibility that the differences in the Vmax values reflect differences in the protein content of the two enzymes, which may also explain the differential chromatographic behavior. Finally, the isolation of RNase P from human peripheral lymphocytes will enable the study of the possible involvement of this ribozyme in the pathogenetic mechanisms of diverse autoimmune, inflammatory and neoplastic cutaneous disorders and may facilitate the further development of RNase P-based technology for gene therapy of infectious and neoplastic dermatoses.

Η ριβονουκλεάση P (RNase P) είναι το ένζυμο που ευθύνεται για την ωρίμανση του 5΄άκρου των πρόδρομων μορίων tRNA συμμετέχοντας έτσι στην πρωτεΐνοσύνθεση. H RNase P καταλύει την ενδονουκλεολυτική θραύση ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού παρουσία ιόντων Mg²⁺ παράγοντας προϊόντα με 3΄υδροξυλικά και 5΄φωσφορικά άκρα. Η πλειοψηφία των RNase P ενζύμων που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνες αποτελούμενες από μια RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες. Η RNA υπομονάδα της βακτηριακής RNase P είναι ένα από τα πρώτα καταλυτικά RNA που μελετήθηκαν. Η RNase P και το ριβόσωμα είναι τα μόνα γνωστά ριβοένζυμα που είναι συντηρημένα και στις τρείς φυλογεννετικές περιοχές (βακτήρια, αρχαία και ευκαριώτες). Η ευκαρυωτική RNase P έχει απομονωθεί από πυρήνες, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες και παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία στην σύσταση των πρωτεΐνικών υπομονάδων. Η πυρηνική RNase P έχει απομονωθεί από διάφορους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και αρχικά από την ζύμη και τον άνθρωπο. Το ανθρώπινο πυρηνικό ολοένζυμο αποτελείται από μία RNA υπομονάδα που ονομάζεται Η1 και δέκα πρωτεϊνικές οι οποίες είναι η Rpp14, Rpp20, Rpp21, Rpp25, Rpp29, Rpp30, Rpp38, Rpp40, hPop1 και hPop5. Πρόσφατα δείχτηκε πως η RNA υπομονάδα της ανθρώπινης RNase Ρ διατηρεί ίχνη καταλυτικής δραστικότητας. Δεδομένης της ζωτικής σημασίας των λεμφοκυττάρων στην ακεραιότητα του ανοσολογικού συστήματος και στην παθογένεια ευρέος φάσματος δερματολογικών και μη νοσημάτων, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την απομόνωση και τον καθαρισμό της. Δεδομένης της ζωτικής σημασίας των λεμφοκυττάρων στην ακεραιότητα του ανοσολογικού συστήματος και στην παθογένεια ευρέος φάσματος δερματολογικών και μη νοσημάτων, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την απομόνωση και τον καθαρισμό της RNase P από περιφερικά λεμφοκύτταρα υγιών μαρτύρων, ο προσδιορισμός της ενζυμικής της δραστικότητας, καθώς και η μελέτη της in vitro επιδράσεως δύο συνθετικών ρετινοειδών, του 13-cis ρετινοϊκού οξέος και της ασιτρετίνης, της αμινογλυκοσίδης νεομυκίνης Β, όπως και της διφωσφορικής χλωροκίνης στην δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Το ένζυμο καθαρίστηκε με τη χρήση κατιοντοανταλλακτικής χρωματογραφίας φωσφοκυτταρίνης. Η RNase P εκλούστηκε με γραμμική βαθμίδωση συγκέντωσης NH₄Cl από 50-500 mΜ. Το μέγιστο της δραστικότητας εκλούστηκε σε 285mM NH₄Cl, σε αντίθεση με το ένζυμο της RNase P από τα επιδερμιδικά κερατινοκύτταρα, του οποίου το μέγιστο της δραστικότητας εκλούεται σε 190mM NH₄Cl. Τα πειράματα για την ανίχνευση του ενζύμου πραγματοποιήθηκαν με την χρήση ενός ραδιενεργά σημασμένου in vitro μεταγραφήματος του tRNA της σερίνης από τον Schizosaccharomyces pombe (SupS1). Τα προϊόντα της ενζυμικής αντίδρασης αναλύθηκαν σε αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10%, 8Μ ουρίας, έγιναν ορατά μέσω Phosphorimager FLA 3000 (FUJIFILM) και ποσοτικοποιήθηκαν με το πρόγραμμα PCBAS/AIDA (Raytest). Μετά από μελέτη της επίδρασης των συνθετικών ρετινοϊδών (13-cis ρετινοϊκό οξύ και ασιτρετίνη) και της νεομυκίνης Β στην δραστικότητα της RNase P, προέκυψε ότι το 13-cis ρετινοϊκό οξύ (ισοτρετινοΐνη), η ασιτρετίνη και η νεομυκίνη Β προκαλούν μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της δραστικότητας της RNase Ρ των ανθρωπίνων λεμφοκυττάρων. Η διφωσφορική χλωροκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Λεπτομερής κινητική ανάλυση έδειξε πως η αναστολή που προκαλείται από την ασιτρετίνη είναι συναγωνιστικού τύπου, ενώ αυτή από την νεομυκίνη Β είναι μη συναγωνιστικού τύπου. Η κινητική σταθερά Km (245 nM) της λεμφοκυτταρικής RNase P είναι παρόμοια με εκείνη της RNase P που απομονώθηκε από φυσιολογικά επιδερμικά κερατινοκύτταρα (Km=233 nM). Η διαφορά, όμως, της σταθεράς Vmax μεταξύ των δυο αυτών ενζύμων (0.42 pmol/min για τη λεμφοκυτταρική RNase P και 2.4 pmol/min για την RNase P από επιδερμικά κερατινοκύτταρα) μπορεί να οφείλεται στη διαφορετική συγκέντρωση ενζύμου που χρησιμοποιήθηκε για την κινητική μελέτη. Δεν μπορεί παρόλα αυτά να αποκλειστεί η πιθανότητα, αυτή η διαφορά της σταθεράς Vmax μεταξύ των δυο ενζύμων να αντανακλά διαφορές στην πρωτεϊνική τους σύσταση, γεγονός που επίσης εξηγεί τη διαφορετική χρωματογραφική συμπεριφορά τους. Συμπερασματικά, η απομόνωση της RNase P από ανθρώπινα περιφερικά λεμφοκύτταρα καθιστά δυνατή τη μελέτη της πιθανής ανάμιξης αυτού του ριβοενζύμου στους παθογενετικούς μηχανισμούς διαφόρων αυτοάνοσων, φλεγμονωδών και νεοπλασματικών δερματοπαθειών και μπορεί να διευκολύνει τη περαιτέρω ανάπτυξη της βασιζομένης στην RNase P τεχνολογίας για τη γονιδιακή θεραπεία δερματικών και μη παθήσεων.