Φυλογένεση και γενετική δομή του λαγού (Lepus europaeus) με τη χρήση μοριακών τεχνικών

Abstract

The brown hare (Lepus europaeus Pallas, 1778) is widespread throughout Europe, occurring in a variety of environments. It has considerable economic importance because it is one of the most important game species in Europe and especially in the Balkan Peninsula and Greece. The extensive distribution of this species and the fact that its populations responds rapidly to environmental and habitat changes, make this species a suitable model for the study of the behaviour, biology and genetic structure of wild mammals populations. In this thesis we analysed the population genetics of the brown hare (Lepus europaeus) in European, Greek and Anatolian populations, using sequencing, PCRRFLP and PCR-SSCP methods, performed on mtDNA and Y-DNA genes, in order to:  assess the genetic differentiation and the phylogenetic status of brown hare populations  test the hypothesis that this species migrated into central Europe from a number of late glacial refugia, including some in Asia Minor  estimate the genetic structure of reared populations and the impact of the releases on the native populations genetic structure  develop molecular markers for the identification of reared and native populations The conclusions drawn from the study are the following:  Colonization of large parts of Europe started from only one late glacial/early Holocene source population in the central or south-central Balkans, and it was relatively quick. This contradicts Bilton et al., (1998), who suggested colonization of central Europe by some small mammals from Late Pleistocene refugees in eastern Europe and western Siberia, as an alternative to colonization from Mediterranean refugees.  So far, mtDNA of non-introgressed brown hares from Iberia have standard central European haplotypes, suggesting no late Pleistocene refuge in Iberia.  In Bulgaria and northeastern Greece all haplogroups were present, forming a large introgression zone.  Gene flow from Anatolia to Europe, across the late Pleistocene Bosporus land bridge, was detected.  Brown hares from the British Isles had very low mtDNA polymorphism showing that they do not consitute a separate subspecies (L. e. occidentalis), as previously suggested. Northern Germany could be a possible source region of the current populations.  Over hunting and continuous releases of brown hares could explain the massive presence of EU-A haplotypes in central and northern Italy. This practice might have replaced the native and possibly originally widespread SEE haplotypes. Our data contradict the idea of the existence of the subspecies L. e. meridiei in the Italian peninsula.  Although various restocking operations could be partly responsible for the presence of unexpected haplotypes in certain areas, we nevertheless trace a strong phylogeographic signal throughout all regions under study.  Phylogenetic trees produced by the comparison of mt tRNA genes are similar compared to those that are produced by the standard methods.  Molecular investigations on mt tRNA could serve as valuable accessory elements for connecting analysis of precise and unimpeded biochemical function in mitochondria with evolutionary and phylogenetic studies.  We assume that the tRNA genes that were used for the present analysis accumulated mutations in positions that do not seem to affect their role in mitochondrial protein synthesis.  These tRNA recorded evolutionary changes that can be directly connected with the distinct phylogeographic distribution of L. europaeus. The fact that the observed nucleotide substitutions appear in a large portion of the L. europaeus individuals indicates that they are tolerated by natural selection pressure.  Consistent with previous data, phylogenetic analysis of Cytb gene corroborates the existence of four different haplogroups with a well defined distribution across Europe and Anatolia.  The analysis consistently supports the deep separation of Anatolian (Turkey and Israel) and European lineages of L. europaeus at the mtDNA level.  Contrary to other biparental nuclear markers, Y-DNA data underline the existence of two major phylogenetic clades within L. europaeus species between Anatolia and Europe.  Unlike mtDNA, Anatolian Y-DNA extended into central Greece, where it was detected in few individuals. It is very likely, that the tendency toward philopatry of female brown hares makes mtDNA introgression more difficult in comparison with Y-DNA, resulting in different distributional patterns.  In contrast to natural populations, reared populations showed relatively little genetic variation, as revealed by mtDNA and RAPDs. Greek populations have also higher levels of genetic variation than populations from Central Europe. The only advantage that the released animals could confer is the enrichment of the already rich Greek mtDNA genetic pool, given the absence of the “reared” mtDNA haplotypes from Greece. In that case there is still a question of “outbreeding depression” from locally maladapted genes imported with the allocthonous animals. Bulgaria and now, after the releases, north-eastern Greece are the only European regions where all four types of mtDNA profile occur. In both cases either there are no data or it is too early to conclude any possible interaction between the different types of haplotypes. If, in the long run, introgressed foreign genes survive, forming new genotypes with indigenous genes, this would in fact demonstrate that they are successful in terms of competition. As nuclear gene pools are not too divergent between Greek and other European hares, foreign nuclear genes should not be a serious handicap. Hence, in certain situations releasing programs might be tolerated under obeying all other non-genetic strict controls.

Ο ευρωπαϊκός λαγός (Lepus europaeus Pallas, 1778) αποτελεί ένα ευρέως διαδεδομένο είδος στην Ευρώπη, με μεγάλη ποικιλία ενδιαιτημάτων και ιδιαίτερη οικονομική σημασία, διότι αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα θηράματα στην Ευρώπη και ιδιαίτερα στη Βαλκανική χερσόνησο και την Ελλάδα. Η εκτεταμένη κατανομή του και το γεγονός ότι οι πληθυσμοί του ανταποκρίνονται ταχύτατα στις αλλαγές ενδιαιτημάτων, το καθιστούν ένα είδος-μοντέλο, μέσω του οποίου μπορούμε να εξάγουμε χρήσιμα συμπεράσματα για τη συμπεριφορά, τη βιολογία και την πληθυσμιακή δομή των άγριων πληθυσμών πολλών θηλαστικών. Σε αυτήν τη διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε πληθυσμιακή ανάλυση ενός μεγάλου αριθμού δειγμάτων ευρωπαϊκού λαγού σε ένα εκτεταμένο δίκτυο δειγματοληψίας στην Ευρώπη, την Ελλάδα, την Τουρκία και το Ισραήλ. Η μελέτη στηρίχθηκε στην ανάλυση μοριακών δεικτών του μιτοχονδριακού DNA και δεικτών του πυρηνικού DNA (χρωμόσωμα Y), χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως PCR-RFLP, PCR-SSCP και αλληλούχηση διαφόρων περιοχών DNA. Οι βασικοί στόχοι της μελέτης αποτυπώνονται ως εξής: • Μελέτη της γενετικής δομής των φυσικών πληθυσμών του λαγού και της γονιδιακής ροής μεταξύ των περιοχών δειγματοληψίας • Έλεγχος της υπόθεσης της μετανάστευσης του ευρωπαϊκού λαγού προς την Κεντρική Ευρώπη από καταφύγια της Βαλκανικής χερσονήσου καθώς και της Μικράς Ασίας, κατά την τελευταία Περίοδο των Παγετώνων • Μελέτη της γενετικής δομής των εκτρεφόμενων πληθυσμών του λαγού, εκτίμηση της γονιδιακής ροής ανάμεσα σε εκτρεφόμενους και φυσικούς πληθυσμούς • Εύρεση μοριακών δεικτών σε επίπεδο μιτοχονδριακού DNA, για την ταυτοποίηση των εκτρεφόμενων και των φυσικών πληθυσμών.

Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από τη μελέτη είναι τα εξής: • Ο εποικισμός μεγάλων περιοχών της Ευρώπης με ευρωπαϊκούς λαγούς, άρχισε στο τέλος της τελευταίας παγετωνικής περιόδου και στην αρχή του Ολόκαινου, από έναν μόνο αρχικό πληθυσμό των κεντρικών ή νοτιο-κεντρικών Βαλκανίων και υπήρξε σχετικά ταχύτατος. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την υπόθεση εποικισμού της Ευρώπης από μερικά μικρά θηλαστικά, κατά το τέλος του Πλειστόκαινου, από μερικά καταφύγια της ανατολικής Ευρώπης και της δυτικής Σιβηρίας. • Οι μέχρι τώρα αναλύσεις έδειξαν ότι στην Ιβηρική χερσόνησο τα μη υβριδισμένα άτομα ευρωπαϊκού λαγού έχουν τους κλασσικούς απλότυπους στο mtDNA, γεγονός που αποκλείει την περιοχή αυτή από το να έπαιξε το ρόλο καταφυγίου για το L. europaeus κατά τον Πλειστόκαινο. • Στη Βουλγαρία και τη βορειοανατολική Ελλάδα είναι παρούσες όλες οι απλοομάδες, δημιουργώντας μια εκτεταμένη περιοχή επικάλυψης όλων των απλοτύπων. • Ανιχνεύθηκε γονιδιακή ροή από την Ανατολία προς την Ευρώπη, πιθανότατα κατά τη διάρκεια της τελευταίας περιόδου του Πλειστόκαινου, μέσω της γέφυρας του Βοσπόρου. • Οι ευρωπαϊκοί λαγοί από τη Μ. Βρετανία εμφάνισαν πολύ χαμηλό πολυμορφισμό, αλλά φαίνεται πως δεν αποτελούν ένα ξεχωριστό υποείδος (L. e. occidentalis), όπως είχε θεωρηθεί παλαιότερα. Η βόρεια Γερμανία θα μπορούσε να είναι η περιοχή προέλευσης των σύγχρονων πληθυσμών της Βρετανίας. • Η υπερθήρευση και οι συνεχείς απελευθερώσεις αλλόχθονων λαγών θα μπορούσαν να εξηγήσουν τη μαζική παρουσία των απλοτύπων της ευρωπαϊκής ομάδας EU-A στην κεντρική και βόρεια Ιταλία. Η πρακτική αυτή ίσως συνέβαλε στην αντικατάσταση των γηγενών απλοτύπων SEE που πιθανώς ήταν διαδεδομένοι αρχικά. Τα δεδομένα μας απορρίπτουν την ύπαρξη ενός διαφορετικού υποείδους (L. e. meridiei) στην Ιταλική χερσόνησο. • Αν και οι πολλές επιχειρήσεις εμπλουτισμού και ανθρωπογενών απελευθερώσεων ευρωπαϊκού λαγού που έχουν πραγματοποιηθεί θα μπορούσαν να εξηγήσουν την παρουσία μη αναμενόμενων απλοτύπων σε ορισμένες περιοχές, εντούτοις ανιχνεύθηκε ένα έντονο φυλογεωγραφικό σήμα σε όλες τις περιοχές που μελετήθηκαν. • Τα φυλογενετικά δένδρα που προέκυψαν από την ανάλυση των γονιδίων tRNA του mtDNA ήταν συγκρίσιμα με αυτά που έδωσαν τα υπόλοιπα μιτοχονδριακά τμήματα. Είναι πολύ πιθανό ότι τα γονίδια tRNA που αναλύθηκαν, συσσώρευσαν μεταλλάξεις σε θέσεις οι οποίες δεν επηρεάζουν το ρόλο τους στη μιτοχονδριακή σύνθεση των πρωτεϊνών. • Οι μοριακές αναλύσεις αυτών των γονιδίων tRNA μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως πολύτιμα βοηθητικά εργαλεία για την σύνδεση της ακριβούς βιοχημικής λειτουργίας των μιτοχονδρίων με τις εξελικτικές και φυλογενετικές μελέτες. • Η μελέτη των tRNAs κατέγραψε εξελικτικές αλλαγές που μπορούν να συνδεθούν άμεσα με τη διακριτή φυλογεωγραφική κατανομή του L. europaeus. Το γεγονός ότι οι νουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις που ανιχνεύθηκαν εμφανίζονται σε ένα μεγάλο ποσοστό των ατόμων του L. europaeus υποδηλώνει ότι είναι ανεκτές από την πίεση της φυσικής επιλογής. • Σε συμφωνία με τα υπόλοιπα φυλογενετικά δεδομένα του mtDNA, η ανάλυση του γονιδίου Cytb επιβεβαιώνει την ύπαρξη τουλάχιστον τεσσάρων διαφορετικών απλοομάδων με πολύ καλά προσδιορισμένη κατανομή στην Ευρώπη και την Ανατολία. • Η ανάλυση του Cytb υποστηρίζει επίσης το βαθύ διαχωρισμό των πληθυσμών του L. europaeus ανάμεσα στην Ανατολία (Τουρκία και Ισραήλ) και την Ευρώπη σε επίπεδο mtDNA. • Σε αντίθεση με τους διγονεϊκούς πυρηνικούς μοριακούς δείκτες, τα δεδομένα του Y-DNA υποστηρίζουν την ύπαρξη δύο βασικών φυλογενετικών κλάδων για το είδος L. europaeus ανάμεσα στην Ευρώπη και την Ανατολία. • Σε αντίθεση με το mtDNA, ο τύπος του Y-DNA της Ανατολίας εντοπίστηκε και σε μερικά άτομα της κεντρικής Ελλάδας. Είναι πολύ πιθανό ότι η τάση για φιλοπατρία των θηλυκών ευρωπαϊκών λαγών, καθιστά την εισδοχή του mtDNA πιο δύσκολη σε σχέση με το Y-DNA και καταλήγει σε διαφορετικά πρότυπα κατανομής. • Οι ελληνικοί πληθυσμοί του L. europaeus εμφανίζουν πολύ μεγαλύτερη γενετική ποικιλότητα σε σχέση με τους εκτρεφόμενους αλλά και τους κεντροευρωπαϊκούς πληθυσμούς, όπως συνάγεται από τα δεδομένα του mtDNA και των RAPDs. Επομένως, θα ήταν άστοχο να χρησιμοποιηθούν απελευθερώσεις εκτρεφόμενων ατόμων για να εμπλουτιστεί η ήδη πλούσια γενετική δεξαμενή των ελληνικών πληθυσμών. • Το επόμενο διαχειριστικό ερώτημα είναι εάν θα υπάρξει το φαινόμενο της γενετικής κατάπτωσης μετά από ανάμιξη των τοπικών γονιδιακών δεξαμενών με μη προσαρμοσμένα γονίδια εισαγόμενων ατόμων. Η Βουλγαρία και πλέον, μετά τις απελευθερώσεις, η βορειοανατολική Ελλάδα είναι οι μόνες περιοχές της Ευρώπης όπου συνυπάρχουν και οι τέσσερεις απλοομάδες. Και στις δύο περιπτώσεις δεν υπάρχουν τα κατάλληλα δεδομένα για να αποφανθούμε ως προς τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφόρων απλοομάδων. Εάν, μακροχρόνια, τα εισαγόμενα ξένα γονίδια επιβιώσουν, δημιουργώντας νέους γενότυπους με τα ήδη υπάρχοντα, θα αποδειχθεί ότι αυτά μπορούν να προσαρμοστούν. Καθώς τα πυρηνικά γονίδια δεν είναι ιδιαίτερα διαφοροποιημένα μεταξύ των πληθυσμών της Ελλάδας και της υπόλοιπης Ευρώπης, τα ξένα πυρηνικά γονίδια δεν θα αποτελέσουν ένα σοβαρό μειονέκτημα. Επομένως, υπό τις συγκεκριμένες περιπτώσεις, τα προγράμματα απελευθερώσεων θα μπορούσαν να ενταχθούν σε ένα διαχειριστικό σχήμα, με την προϋπόθεση ότι και όλες οι άλλες μη γενετικές παράμετροι λαμβάνονται υπόψη και ελέγχονται αυστηρά.