Δείκτες πολλαπλασιασμού και απόπτωσης σε φυσιολογικές και παθολογικές γονάδες

Abstract

Aim of the present study is the correlation of germ and epithelial cells kinetics during testicular and ovarian morphogenesis in Wistar rat embryos and neonates [14,5 18,5 20,5 days post conception (dpc) birth (22,5 days) 1, 3, 5, 7 days post-partum (dpp)] by immunohistochemistry using PCNA and Ki-67 nuclear antibodies. Estimation of reactive/total cell ratio per visual field [labeling index (LI)] is achieved using Image Pro Plus Software Immunostaining of the fetal testis with both antibodies reveals two peaks of proliferative activity of germ cells while after birth a transient increase between 3 and 5 dpp is observed. Then the mitotic activity of germ cells ceases. Meanwhile a gradual increase of immunolabeled Sertoli cells number is observed throughout the examined period. In the fetal ovary germ cells proliferative activity reaches a peak value and drops afterwards until birth. At this time mitotic activity ceases and oogonia enter prophase of metosis I. In the neonatal ovary the LI of germ cells increases up to 1 dpp and subsequently decreases resulting to a maximum drop at 7 dpp. Follicular cells reaction ratio using both antibodies increases continuously throughout the examined period with a maximum value at 7 dpp. Following estimation of the LI for PCNA and Ki-67 in both sexes a prominent labeling for the first antibody is observed throughout the examined period. The significant differences between the two markers don’t seem to be simply a result of their different half-lives but rather a consequence of additional underlying cellular activity associated with PCNA such as DNA repair Immunostaining for Bax protein is more prominent at 20,5 dpc in spermatogonia of the fetal testis and at 21,5 dpc in oocytes of the fetal ovary Bcl-2 protein is expressed during the same period in both sexes. Postnatally at 1 dpp bcl-2 is predominantly expressed in spermatogonia while at 5 dpp tissue reaction to both antibodies is the same. Accordingly apoptosis ceases in the male gonad Reaction of primary oocytes to Bcl-2 is more intense at 5 dpp in order to ensure the maintenance of a constant oocyte population up to the reproductive period. Gonadal dimorphism can be established only in case of germ cells proliferative behaviour during the perinatal period while Sertoli and follicular cells behave similarly in both sexes showing increased mitotic activity throughout the examined period.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής έρευνας είναι η συσχέτιση της κινητικής των γεννητικών και επιθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της ορχικής και ωοθηκικής μορφογένεσης σε έμβρυα και νεογνά αρουραίων Wistar ηλικίας 14,5 ήμερων πριν από τη γέννηση (Ε) Ε18,5 Ε20,5 Ε22,5 (κατά τη γέννηση) 1 ημέρας μετά τη γέννηση (ΗΜΓ) 3, 5 και 7 ΗΜΓ με ανοσοϊστοχημική εντόπιση των πυρηνικών αντιγόνων PCNA και Κι-67. Η εκτίμηση του δείκτη σήμανσης (αριθμός κυττάρων που αντιδρούν στον αντιορό προς το σύνολο των κυττάρων επί τοις %) γίνεται μέσω του λογισμικού Image Pro Plus. Στον εμβρυϊκό όρχι παρατηρούνται δύο αιχμές μιτωτικής δραστηριότητας των γεννητικών κυττάρων ενώ μετά τη γέννηση σημειώνεται ενεργοποίηση του μιτωτικού μηχανισμού στο διάστημα 3-5 ΗΜΓ. Στη συνέχεια ο πολλαπλασιασμός των γεννητικών κυττάρων διακόπτεται. Παράλληλα παρατηρείται βαθμιαία αύξηση του ποσοστού των αντιδρώντων κυττάρων Sertoli με την ηλικία. Στην εμβρυϊκή ωοθήκη ο δείκτης σήμανσης των γεννητικών κυττάρων φθάνει στο μέγιστο πριν από τη γέννηση γεγονός που συμπίπτει χρονικά με την είσοδο των ωογονιών στην πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης. Μετά τη γέννηση τα γεννητικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται μέχρι 1 ΗΜΓ και στη συνέχεια ο δείκτης σήμανσης φθίνει (ελάχιστη τιμή στις 7 ΗΜΓ). Το ποσοστό των αντιδρώντων θυλακικών κυττάρων και για τους δύο δείκτες πολλαπλασιασμού αυξάνει κατά την περίοδο μελέτης με αιχμή στις 7 ΗΜΓ. Παρατηρείται υπεροχή στην έκφραση του PCNA έναντι του Ki-67 και στα δύο φύλα γεγονός το οποίο μπορεί να ερμηνευτεί αν ληφθούν υπόψη όχι μόνο ο διαφορετικός χρόνος ημίσιας ζωής των δυο πυρηνικών αντιγόνων αλλά και η συμμετοχή του PCNA σε μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA μετά τη βλάβη. Η πρωτεΐνη Bax εκφράζεται πιο έντονα την Ε20,5 στα σπερματογόνια του εμβρυϊκού όρχι και την Ε21,5 στα ωογόνια της ωοθήκης. Η πρωτεΐνη Bcl-2 εκφράζεται την ίδια περίοδο και στα δύο φύλα. Μετά τη γέννηση στο αρσενικό παρατηρείται εντονότερη έκφραση της Bcl-2 την 1 ΗΜΓ ενώ στις 5 ΗΜΓ η αντίδραση των σπερματογονιών είναι η ίδια και για τα δυο αντίγονα με αποτέλεσμα διακοπή της αποπτωτικής διεργασίας. Η αντίδραση των ωοκυττάρων Ι στη Bcl-2 είναι πιο έντονη στις 5 ΗΜΓ προκειμένου να εξασφαλιστεί η διατήρηση σταθερού αριθμού ωοκυττάρων κατά την αναπαραγωγική ζωή του θηλυκού. Φυλετικός διμορφισμός παρατηρείται στα γεννητικά κύτταρα κατά την περιγεννητική περίοδο ενώ τα θυλακικά και τα κύτταρα Sertoli εμφανίζουν λειτουργική αναλογία με αυξανόμενα ποσοστά αντιδρώντων κυττάρων κατά την περίοδο μελέτης.