Μελέτη της ευαισθησίας των μπαρτονελλών στις κινολόνες

Abstract

Objectives. Our objective was to evaluate in vitro antibiotic susceptibilities of 20 new Bartonella isolates from animals in Australia. Moreover, we have determined the sequences of the QRDR of gyrA gene for these isolates and compared them with the available sequences of Bartonella reference strains in order to explain the molecular basis of the heterogeneity of susceptibility to fluoroquinolone compounds. Moreover, in order to expend our knowledge on fluoroquinolones resistance, we obtained in vitro ciprofloxacin resistant strains of B. henselae, the agent of cat scratch disease (CSD), and B. quintana, the agent of trench fever. Finally in another study, our objective was to detect and identify, by molecular methods, the presence of Bartonella species in wild rodents from the Lao PDR (Laos), a country where epidemiological and clinical studies of zoonoses are scarce. Materials and methods. MICs were determined using Etest assay on Columbia agar supplemented with 5% horse blood. The presence of mutations in the quinolone-resistance-determining region (QRDR) of gyrA, and in gyrB, parC and parE was searched for after PCR amplification and DNA sequencing using specific oligonucleotide primers. Total genomic DNA was extracted from livers and spleens from rodents from LAOS. Samples were screened for the presence of Bartonella species by the use of a real-time (RT) quantitative PCR and standard PCR amplification and sequencing targeting the ITS gene. Results. We found heterogeneity of susceptibility for fluoroquinolones with ciprofloxacin being more effective (MICs from 0.06 to 0.5 mg/L) than ofloxacin (MICs from 0.5 to 4 mg/L). This heterogeneity was linked to a natural mutation Ser-83> Ala in the QRDR. The ciprofloxacin-resistant strain when compared with the sensitive strains, harboured a C-549>T transition of the gyrA gene, encoding predicted amino acid change Asp-87>Asn in the gyrase A protein. No mutations were found for the gyrB, parC and parE genes. 79 rodents (25.5%) were positive for Bartonella by RT-PCR. Using standard ITS PCR and sequencing we identified the presence of 5 Bartonella species, including B. phoceensis, B. elizabethae, B. tribocorum, and two new Bartonella species which we named Lao/Nh1 and Lao/Nh2, in three different regions of Laos Conclusion. Heterogeneity of susceptibility among fluoroquinolones was associated with natural mutation in the QRDR of the DNA gyrase. Because a high level of resistance to fluoroquinolones due to a second mutation may be obtained easily in vitro, we believe that fluoroquinolone compounds should be avoided for the treatment of any Bartonella-related diseases. We report for the first time the molecular detection of five Bartonella species (including two new Bartonella spp.) in rodents trapped from the Lao PDR (Laos). The Bartonella species identified may be a source of new unidentified human diseases caused by Bartonella species in Laos.

Σκοπός μας ήταν να προσδιοριστεί η ευαισθησία των μπαρτονελλών στις στα αντιβιοτικά. Προσδιορίστηκαν οι MICs 11 αντιβιοτικών με την χρήση E-test, για 20 Bartonella sp., που απομονώθηκαν από ζώα στην Αυστραλία. Καθώς βρήκαμε ποικιλόμορφη αντίδραση των Μπαρτονέλλων στις κινολόνες, αποφασίσαμε να μελετήσουμε την γενετική αιτία αυτής της ποικιλομορφίας . Επίσης για να ολοκληρώσουμε την μελέτη πάνω στην αντοχή των Μπαρτονελλών στις κινολόνες, δημιουργήσαμε ανθεκτικά στελέχη στις κινολόνες και κατόπιν προσδιορίσαμε την γονιδιακή αλληλουχία των gyrA, gyrB, parC και parE. Τελος, πραγματοπoιήσαμε την πρώτη επιδημιολογική έρευνα για την ύπαρξη Μπαρτονελλών στο ΛΑΟΣ . Μεθοδολογία. Με την μέθοδο του E-test, μελετήσαμε 20 Bartonella species που απομονώθηκαν από το αίμα άγριων ζώων από την Αυστραλία καθώς και 4 στελέχη αναφοράς . Παράλληλα αναπτύχθηκαν ανθεκτικά στη σιπροφλοξασίνη στελέχη αναφοράς B. quintana και B. henselae.Εκχυλίσαμε το DNA από όλα τα στελέχη και πραγματοποιήσαμε PCR με primers που στόχευαν τα γονίδια gyrA, gyrB, parC και parE. Οι αλληλουχίες των αμινοξέων μεταφράστηκαν σε πρωτείνες με το πρόγραμμα “DNA TO PROTEIN TRANSLATION”. Σε ανεξάρτητη έρευνα, διερευνήσαμε την ύπαρξη Bartonella sp., σε τρωκτικά από το ΛΑΟΣ με την χρήση real-time PCR. Με τη χρήση PCR-sequencing analysis με βάση τα γονίδια ITS, rpoB, gltA έγινε ταυτοποίηση και φυλογενετική ανάλυση των μπαρτονελλών που ανιχνεύτηκαν. Αποτελέσματα. Η σύγκριση της QRDR περιοχής και για τις 24 Bartonella species αποκάλυψε μια φυσική μετάλλαξη στη θέση 83 της QRDR (Σερίνη>83 Αλανίνη) για όλα τα στελέχη. Ανθεκτικά στελέχη B. henselae αναπτύχθηκαν in vitro μετά απο 4 ανακαλλιέργειες ενώ για την B. quintana μετά απο 5 (MIC από 0.38 σε >45mg/L και για τα δυο στελέχη). Τα ανθεκτικά στελέχη έφεραν μια μετάλλαξη στην θέση 87 της QRDR (Asp>87Asn). Τα gyrB, parC και parE γονίδια δεν έφεραν μεταλλάξεις. Ελέγχθηκαν 568 ιστοί (ήπαρ,σπλήνας) από 310 τρωκτικά. Από τα δείγματα που μελετήθηκαν, με τη χρήση RT-PCR, 128 ιστοί (22.5%) από 79 τρωκτικά (25.5%), βρέθηκαν θετικοί για Μπαρτονέλλα. Με τη χρήση PCR-sequencing analysis με βάση τα γονίδια ITS, rpoB, gltA ταυτοποιήθηκαν τα παρακάτω τρια είδη μπαρτονέλλας: B. phoceensis, B. elizabethae και B. tribocorum, καθώς και δυο νέων Μπαρτονελλών που τις ονομάσαμε Lao/Nh1 and Lao/Nh2. Συζήτηση. Η ποικιλόμορφη αντίσταση των Bartonella species στις κινολόνες σε συνδυασμό με την γρήγορη ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών μας οδηγεί στο συμπέρασμα οτι οι κινολόνες δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για την μακροχρόνια θεραπεία Μπαρτονελλώσεων. Ανακαλύψαμε επίσης την παρουσία Μπαρτονέλλας στο ΛΑΟΣ.