Έλεγχος διαφοροποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων

Abstract

Introduction: Stem cells (SCs) are undifferentiated cells, which possess the unique ability to divide asymmetrically. This division produces an undifferentiated quiescent cell (renewal of SC) along with a progenitor cell in mitosis committed to proliferation and differentiation.There are two kinds of SCs: the embryonic SC and the adult SC. The embryonic SCs are totipotent cells that can generate each and every kind of embryonic and adult cell types in vivo and in vitro, although they cannot support the genesis of an entire organism on their own. The adult multipotent SCs reside within specific tissues of the organism and are pivotal for the lifelong maintenance of cell homeostasis and the regeneration of dysfunctional or damaged tissues.There are two distinct populations of SCs in the bone marrow, the hematopoietic stem cells (HSCs) and the mesenchymal stem cells (MSCs), that might derive from a common primitive blastoid progenitor cell. Hematopoietic stem cells represent only 1 / 10000 - 1 / 100000 of the total blood cells. They are able to interchangeably commit themselves to different cell lineages and are responsible for the maintenance of constitutive hematopoiesis. Their ability of hematopoietic reconstitution is consistent with the expression of CD133, a cell surface antigen and early HSC marker that reacts with the AC133 antibody. The primitive HSCs that react with the AC133 antibody are the AC133+ cells.HSCs can be obtained from various sources, including bone marrow, peripheral blood or cord blood, for clinical purposes. The noninvasive collection of cord blood provides readily available HSCs. However, the limited number of HSC in a single collection and the delay in their engraftment, constrain the use of cord blood in transplantation protocols. The most life threatening risks of allogeneic transplantation are infections and the development of the Graft-versus-Host Disease (GVHD). The current aims of the in vitro culture of cord blood HSCs are to significantly increase the initial HSC dose, reduce the gravity and duration of post transplant neutropenia and thrombocytopenia, and establish novel specific cell therapies for GVHD.Introduction: Stem cells (SCs) are undifferentiated cells, which possess the unique ability to divide asymmetrically. This division produces an undifferentiated quiescent cell (renewal of SC) along with a progenitor cell in mitosis committed to proliferation and differentiation.There are two kinds of SCs: the embryonic SC and the adult SC. The embryonic SCs are totipotent cells that can generate each and every kind of embryonic and adult cell types in vivo and in vitro, although they cannot support the genesis of an entire organism on their own. The adult multipotent SCs reside within specific tissues of the organism and are pivotal for the lifelong maintenance of cell homeostasis and the regeneration of dysfunctional or damaged tissues.There are two distinct populations of SCs in the bone marrow, the hematopoietic stem cells (HSCs) and the mesenchymal stem cells (MSCs), that might derive from a common primitive blastoid progenitor cell. Hematopoietic stem cells represent only 1 / 10000 - 1 / 100000 of the total blood cells. They are able to interchangeably commit themselves to different cell lineages and are responsible for the maintenance of constitutive hematopoiesis. Their ability of hematopoietic reconstitution is consistent with the expression of CD133, a cell surface antigen and early HSC marker that reacts with the AC133 antibody. The primitive HSCs that react with the AC133 antibody are the AC133+ cells.HSCs can be obtained from various sources, including bone marrow, peripheral blood or cord blood, for clinical purposes. The noninvasive collection of cord blood provides readily available HSCs. However, the limited number of HSC in a single collection and the delay in their engraftment, constrain the use of cord blood in transplantation protocols. The most life threatening risks of allogeneic transplantation are infections and the development of the Graft-versus-Host Disease (GVHD). The current aims of the in vitro culture of cord blood HSCs are to significantly increase the initial HSC dose, reduce the gravity and duration of post transplant neutropenia and thrombocytopenia, and establish novel specific cell therapies for GVHD.Objective: The isolation from cord blood of an adequate in number and differentiation potential HSC population.Materials / Methods: 15 cord blood units were collected. They underwent gravity centrifugation followed by the isolation of AC133+ cells using immunomagnetic separation. Cell centrifugation, flow cytometry and semi-solid cultures were performed to characterize the cells. The AC133+ cells obtained were placed in ex vivo expansion and differentiation cultures towards the megakaryocytic, red cell, dendritic cell and mesenchymal cell lineages.Results: All committed progenitor cell lines proliferate as much as 20 times in vitro with the addition of growth factors. In contrast, HSCs remain multipotent for only about a week in culture and then differentiate. Mesenchymal cells can expand remarkably in vitro with growth factors: they expanded about 500 fold in 6 weeks time without signs of senescence of their population.Conclusions: The AC133+ cell, the earliest common primitive HSC, is not only able to self-renew unchanged, but also to differentiate in functional hematopoietic or mesenchymal SCs. We recommend the use of the AC133 positive cell population for the study of the mechanisms of differentiation and self-renewal of HSCs. It is the first time that in vitro differentiation of the cord blood AC133+ cell population was shown to produce both hematopoietic and mesenchymal cells in a uniform study. Despite the adequate proliferation potential of the AC133+ cell population, net growth of the graft’s size is not attained, due to synchronous differentiation. We achieved greater yield (compared to previous investigators) of AC133+ cell differentiation products (hematopoietic and mesenchymal cells) in sufficient numbers for use in cell therapy. Megakaryocytes, dendritic and mesenchymal cells in particular provide very promising clinical applications.

Εισαγωγή: Ο όρος στελεχιαία κύτταρα (ΣΚ) αναφέρεται σεαδιαφοροποίητα κύτταρα τα οποία έχουν τη μοναδική ικανότητα να διαιρούνται ασύμμετρα. Μετά από μια τέτοια διαίρεση, προκύπτει ένα κύτταρο που παραμένει αδιαφοροποίητο και σε φάση ηρεμίας (αυτοανανέωση του ΣΚ) και ένα προγονικό κύτταρο σε φάση μίτωσης, δεσμευμένο προς διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό.Γνωρίζουμε δύο είδη ΣΚ, τα βλαστοκύτταρα (ολοδύναμα στελεχιαία εμβρυονικά κύτταρα) και τα ενήλικα στελεχιαία κύτταρα. Τα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα είναι ολοδύναμα κύτταρα, που διατηρούν την ικανότητα να γεννούν οποιονδήποτε και όλους τους εμβρυϊκούς και ενήλικες κυτταρικούς τύπους in vivo και in vitro, αν και είναι ανίκανα να παράγουν ένα νέο άτομο από μόνα τους. Τα ενήλικα πολυδύναμα ΣΚ παραμένουν σε συγκεκριμένα περιβάλλοντα ή τμήματα ιστών καθ’όλη την διάρκεια της ζωής του οργανισμού και είναι σημαντικά για την δια βίου διατήρηση της ομοιόστασης και την αποκατάσταση δυσλειτουργούντων ή απωλεσθέντων κυτταρικών πληθυσμών σε διάφορους ιστούς.Στον μυελό των οστών διακρίνουμε δύο πληθυσμούς στελεχιαίων κυττάρων: τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και τα μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα, που θεωρείται ότι προέρχονται από έναν κοινό αρχέγονο βλαστοειδή κυτταρικό πρόγονο. Η δομική αιμοποίηση διατηρείται από τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία αποτελούν μόνο το 1 / 10000 - 1 / 100000 των συνολικών κυττάρων του αίματος και είναι τα πιο ευμετάβλητα στο να διέρχονται τα όρια των κυτταρικών γραμμών. Η αιμοποιητική δραστηριότητα αποκατάστασης συμβαδίζει με την έκφραση του αντιγόνου επιφάνειας, CD133, ενός πρώιμου δείκτη του αιμοποιητικού ΣΚ που αντιδρά με το AC133 αντίσωμα. Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα που αντιδρούν με το AC133 αντίσωμα χαρακτηρίζονται ως AC133+ κύτταρα.Για θεραπευτικούς σκοπούς, τα ανθρώπινα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα μπορούν να ληφθούν από διάφορες πηγές, συμπεριλαμβανομένου του μυελού των οστών, του περιφερικού αίματος ή του ομφάλιου αίματος. Το ομφάλιο αίμα παρέχει απεριόριστα άμεσα διαθέσιμα αρχέγονα κυττάρα με μη επεμβατική συλλογή. Η χρήση τους σε πρωτόκολλα μεταμόσχευσης είναι δυσχερής εξαιτίας του περιορισμένου αριθμού αρχέγονων κυττάρων σε μία συλλογή και της καθυστέρησης της αιμοποιητικής ανάκαμψης. Οι μεγαλύτεροι κίνδυνοι που σχετίζονται με τη αλλογενή μεταμόσχευση είναι οι λοιμώξεις και η ανάπτυξη της νόσου του μοσχεύματος εναντίον του ξενιστή (GVHD). Με την ex vivo καλλιέργεια των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων του ομφάλιου αίματος στοχεύουμε στην αύξηση της κυτταρικής δόσης, την μείωση της βαρύτητας και την διάρκειας της ουδετεροπενίας και της θρομβοπενίας μετά την μεταμόσχευση, και την δημιουργία ειδικών κυτταρικών θεραπειών για το GVHD.Σκοπός: Η απομόνωση ενός επαρκούς σε αριθμό και δυναμικό πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης πληθυσμό αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων από ομφάλιο αίμα.Υλικό / Μέθοδοι: Συνελέγησαν 15 μονάδες ομφάλιου αίματος, έγινε επεξεργασία τους με φυγοκέντρηση πυκνότητας και ακολούθησε η απομόνωση των AC133+ κυττάρων με ανοσομαγνητικό διαχωρισμό. Η τυποποίηση των κυττάρων έγινε με κυτταροφυγοκέντρηση, κυτταρομετρία ροής και ημιστερεές καλλιέργειες. Τα AC133+ κύτταρα ετέθησαν σε καλλιέργειες πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης σε μεγακαρυοκύτταρα, ερυθρά, δενδριτικά και μεσεγχυματικά κύτταρα.Αποτελέσυατα: Όλες οι δεσμευμένες βαθμίδες προγονικών κυττάρων που προέκυψαν από την καλλιέργεια AC133+ κυττάρων πολλαπλασιάστηκαν in vitro υπό την επίδραση αυξητικών παραγόντων έως και 20 φορές. Σε αντίθεση, τα αρχέγονα αιμοποιητικά AC133+ κύτταρα παρέμειναν πολυδύναμα στην καλλιέργεια για περίπου μια εβδομάδα και εν συνεχεία διαφοροποιήθηκαν. Απεδείχθη ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα έχουν ιδιαίτερη ικανότητα in vitro πολλαπλασιασμού υπό την επίδραση παραγόντων: πολλαπλασιάστηκαν περίπου 500 φορές σε διάστημα 6 εβδομάδων χωρίς σημεία γήρανσης του πληθυσμού τους.Συυπεράσυατα: To AC133+ κύτταρο είναι το πιο άωρο κοινό αρχέγονο βλαστοειδές προγονικό κύτταρο, ικανό όχι μόνο να αναπαράγεται διατηρώντας ακέραια τα χαρακτηριστικά του αλλά και να διαφοροποιείται προς λειτουργικά αρχέγονα αιμοποιητικά ή μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα. Ο AC133 θετικός πληθυσμός κυττάρων είναι ο καλύτερος για την μελέτη του μηχανισμού διαφοροποίησης / αυτοανανέωσης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Για πρώτη φορά, σε μία ενιαία μελέτη, AC133+ κύτταρα από ομφάλιο αίμα διαφοροποιήθηκαν in vitro σε όλα τα κυτταρικά συστήματα του μυελού των οστών, αιμοποιητικά και μεσεγχυματικά. Ενώ ο πληθυσμός των AC133+ κυττάρων πολλαπλασιάζεται αρκετά, ταυτόχρονα διαφοροποιείται, με αποτέλεσμα να μην επιτυγχάνεται αμιγής μεγέθυνση του αιμοποιητικού μοσχεύματος. Στην παρούσα μελέτη, επιτύχαμε μεγαλύτερη απόδοση παραγωγής, από ότι προηγούμενοι ερευνητές, των προϊόντων διαφοροποίησης των AC133+ κυττάρων (αιμοποιητικών και μεσεγχυματικών κυττάρων) σε ικανούς αριθμούς για χρήση σε κυτταρική θεραπεία. Οι διαφοροποιημένοι πληθυσμοί που μπορούν να χρησιμοποιηθούν με ιδιαίτερη επιτυχία στην κλινική πράξη είναι τα μεγακαρυοκύτταρα, τα δενδριτικά και τα μεσεγχυματικά κύτταρα.