Μελέτη δομής και λειτουργίας γλουταμικής αφυδρογονάσης ειδικής για το νευρικό σύστημα

Abstract

Glutamate dehydrogenase (GDH) an enzyme central to glutamate metabolism is located in the mitochondria In addition there is evidence for extra mitochondrial localization of GDH Human GDH exists in housekeeping (hGDH1) and nerve tissue specific (hGDH2) isoenzymes encoded by the GLUD1 and the GLUD2 genes respectively which differ markedly in their basal activity, allosteric regulation and thermal stability. hGDH2 is thermolabile, shows low basal activity that is fully restored by ADP albeit at higher concentrations than hGDH1, is more sensitive to L-leucine activation and to the synergistic effect of ADP and L-leucine and resistant to GTP inhibition. Site directed mutagenesis of GLUD1 revealed that replacement of Gly456 by Ala made the enzyme resistant to GTP without altering its regulation by ADP. In addition substitution of Ser for Arg443 (which lies in the antenna region of GDH) virtually abolished basal activity made the enzyme extremely sensitive to heat inactivation and totally abrogated the activation of the enzyme by L-leucine. However the presence of low concentrations of ADP (0.025-0.1 mM) permitted the activation of the mutant by L-leucine. Structural modeling implicated that the replacement of Arg443 by Ser may disrupt the H-bond(s) between Arg443 and Ser409 (part of the ascending strand of the antenna) from an adjacent subunit and thus may result in closure of the active catalytic cleft. Substitution of the Ser409 for Arg rendered the enzyme virtually inactive at baseline and resistant to L-leucine activation ADP fully restored the activity of mutant and made it sensitive to L-leucine activation. On the other hand replacement of Ser409 by Asp had a lesser effect on basal activity and to L-leucine activation than Arg substitution. Hence, these data confirm that interaction of adjacent subunits through the Arg443 and Ser409 residues plays a crucial role in setting the basal activity levels. Abrogation of L-leucine activation by R443S S409R or S409D mutants is consistent with the concept that these mutations lead to a closed conformation, which hinders access of L-leucine to the catalytic site for it action. Since the S409R hGDH1 mutant was insensitive to heat denaturation the interaction between the two residues does not seem to be responsible for heat sensitivity. Moreover we created a double hGDH1 mutant that had both Arg443Ser and Gly456Ala in the same polypeptide chain. Functional analyses revealed that the doubly mutated enzyme had similar properties but did not acquire all the characteristics of the wild type hGDH2. Subcellular localization studies were performed using expression vectors for hGDH1 and hGDH2 fused with the enhanced green fluorescence protein (EGFP) that transiently transfected COS 7, HeLa, CHO, HEK 293 and neuroblastoma cell lines. In co-transfection experiments using a mixture of EGFP tagged hGDH1 or hGDH2 and the pDsRed2-Mito vector (a mitochondrial marker) confocal microscopy demonstrated an identical fluorescence pattern in merged pictures thus confirming the mitochondrial localization of both human GDHs. In addition a small fraction of the hGDH1 (or hGDH2) was found to co-localize with endoplasmic reticular marker pDsRed2-ER. There was no evidence for the nuclear or cytoplasmic localization of either GDH isoforms.

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) ένα ένζυμο με σημαίνοντα ρόλο στο μεταβολισμό τουγλουταμικού θεωρείται πως εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, μολονότι νεότερες μελέτες έδειξαν εντόπισή της και εξωμιτοχονδριακά. Στον άνθρωπο υπάρχει σε δυο ισόμορφες. Η πρώτη (hGDH1) κωδικοποιείται από το γονίδιο GLUD1 το οποίο εκφράζεται σε όλους τους ιστούς (house-keeping), ενώ η δεύτερη (hGDH2) κωδικοποιείται από ένα φυλοσύνδετο μη περιέχων ιντρόνια γονίδιο (GLUD2), το οποίο εκφράζεται ειδικώς στο νευρικό σύστημα και στους όρχεις. Η wild type hGDH1 είναι θερμοανθεκτική, έχει βασική δραστηριότητα 40 45% της μέγιστης και αναστέλλεται ισχυρά από το GTP σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις. Η wild type hGDH2 είναι θερμοασταθής, εμφανίζει χαμηλή βασική δραστηριότητα (5-10 % της μέγιστης) και δεν αναστέλλεται από το GTP. Ενεργοποιείται πλήρως σε αυξημένες συγκεντρώσεις ADP. Η λευκίνη δρα ως αλλοστερικός ενεργοποιητής σε μεγαλύτερο ποσοστό της hGDH2 απ’ ότι της hGDH1 και ενεργεί συνεργικά με το ADP σε μικρές συγκεντρώσεις. Με μεταλλαξιογένεση σε θέσεις στις οποίες διαφέρουν τα δυο ισοένζυμα βρέθηκε πως η αντικατάσταση της Gly 456 από Ala προσδίδει την ανθεκτικότητα στο GTP. Μια δεύτερη αντικατάσταση (Arg443 από Ser) ελαχιστοποιεί την βασική δραστικότητα (~3% της μέγιστης) και αποτρέπει την ενεργοποίηση από τη λευκίνη. Μικρές όμως ποσότητες ADP επιτρέπουν στη λευκίνη να το ενεργοποιήσει έως και >2,000%. Τέλος η Arg443 φαίνεται πως είναι υπεύθυνη για την ευαισθησία στη θερμική αδρανοποίηση της wild type hGDH2. Η Arg443 βρίσκεται στην μικρή έλικα της κατερχόμενης αλυσίδας της antenna και συνδέεται με δεσμούς υδρογόνου με τη Ser 409 της ανερχομένης α-έλικας της antenna γειτονικής υπομονάδας. Με σκοπό να εμβαθύνουμε περαιτέρω στον τρόπο ρύθμισης της wild type hGDH2 δημιουργήσαμε με μεταλλαξιογένεση θέσης 2 μεταλλαγμένες ισομορφές με αντικατάσταση της Ser409 με Arg ή Asp. Η Ser409Arg μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνισε πολύ χαμηλή βασική δραστηριότητα ανθεκτικότητα στη δράση του ADP και της λευκίνης και ευαισθησία στη συνεργική δράση ADP λευκίνης στη θερμική αδρανοποίηση. Η Ser409Asp μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνιζε χαμηλή βασική δραστηριότητα (3-5% της μέγιστης) και σημαντικά μικρότερη ανθεκτικότητα στην ενεργοποίηση από λευκίνη, ενώ διαπιστώθηκε συνεργεία μεταξύ ADP και L-λευκίνης μόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις ADP. Τα ανωτέρω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν πως η βασική αίτια της χαμηλής βασικής δραστηριότητας της wild type hGDH2 οφείλεται στην αλληλεπίδραση της Arg443 μιας υπομονάδος με την Ser409 γειτονικής υπομονάδας μέσω δεσμών Η, που αποτελεί το κριτικό γεγονός για το άνοιγμα/κλείσιμο της καταλυτικής σχισμής. Επιπλέον επιβεβαιώνεται πως η λευκίνη συνδέεται εντός του ενεργού κέντρου και συνεπώς απαραίτητη συνθήκη για τη δράση της αποτελεί η διάνοιξη της καταλυτικής σχισμής, γεγονός που επιτελείται με την αλληλεπίδραση Arg443 και Ser409. Η διπλά μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 που κατασκευάσαμε αναπαρήγαγε τις διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ hGDH1 και hGDH2. Συγκεκριμένα εμφάνισε χαμηλή βασική δραστηριότητα (0.25% της μέγιστης), ήταν ευαίσθητη στη θερμότητα ήταν ~3 φορές πιο ανθεκτική στην ενεργοποίηση από το ADP σε σχέση με την wild type hGDH2 και επέδειξε παρόμοια με την wild type hGDH2 συμπεριφορά στην ανθεκτικότητα αναστολής από το GTP παρουσία ADP. Συνοπτικά υιοθετούσε συμπεριφορά ενδιάμεση της Arg443Ser μεταλλαγμένης hGDH1 και της hGDH2. Τέλος μελετήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση της γλουταμικής αφυδρογονάσης με παροδική συν-διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών COS 7, HeLa, CHO HEK 293 και SH-SY5Y (κυττάρων νευροβλαστώματος) με το χιμαιρικό πλασμίδιο pEGFP-Ν3 GLUD1 (ή GLUD2) και με 3 πλασμιδιακούς φορείς τους pDsRed2-Mito, pDsRed2-Nuc και pDsRed2-ER-δείκτες υποκυτταρικής εντόπισης για συγκεκριμένα κυτταρικά οργανύλλια (μιτοχόνδρια, πυρήνας και ενδοπλασματικό δίκτυο αντιστοίχως). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν και οι δυο ισομορφές hGDH1 και hGDH2 εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στα μιτοχόνδρια. Σε μικρότερο ποσοστό εντοπιζόταν στο ενδοπλασματικό δίκτυο ανθρωπίνων σωματικών και νευρικών κυττάρων, ενώ δεν υφίσταται πυρηνική μορφή GDH.