Έκφραση αγγειογενετικών παραγόντων κατά την ηπατική αναγέννηση μετά από χορήγηση τοξικής δόσης ακεταμινοφαινής σε επίμυς

Abstract

Liver has the capacity to regenerate after partial hepatectomy or after the induction of damage of toxic or viral etiology both inducing a reduction in the amount of functional hepatic parenchyma. Liver regeneration has been exhaustively studied in the past. The majority of studies examined hepatocyte proliferation in the model of partial hepatectomy. Most cases of liver regeneration in humans, is the result of liver damage due to toxic, immunologic or viral etiologies. Acetaminophen is a popular and widely over the counter drug with analgesic and anti-inflammatory properties. Acetaminophen overdosage is considered aprimary cause of premeditated or accidental drug poisoning. More than 5000 cases of acetaminophen poisoning are reported yearly. Out of these 50-100 are lethal. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a pleiotropic molecule secreted by a variety of cell types with a proven role in the proliferation of endothelial cells and in the induction of inflammatory response. Its primary receptors are VEGFR1 (VEGF receptor 1) and VEGFR2 (VEGF receptor 2). Angiopoietins (Angiopoietin 1 – Ang1 and Angiopoietin 2 – Ang2) are responsible for the structural stabilization and remodeling of the vascular network. Primary receptors are Tie1 and Tie2. Aim of the present thesis is the study of the expression and determination of the importance of VEGF and angiopoietins 1 and 2 and their receptors during liver regeneration after the administration of a toxic dose of acetaminophen in rats for a period up to 288 hours post administration. The toxic effect of acetaminophen in liver parenchyma by determining the levels of relevant biochemical indices, examining liver pathology. The duration and characteristics of liver regeneration were also examined. 425 MATERIALS AND METHODS In 11 groups of male Sprague-Dawley weighting 220-240 g a toxic dose of acetaminophen (3.5 g/kg of body weight in tragacanth solution). The animals of one group were sacrificed prior to the administration of acetaminophen (control group) and the other groups were sacrificed 12, 24, 36, 48, 72, 96, 144, 192, 240 and 288 hours post administration. Prior to sacrifice blood was drawn from the heart and livers were excised for biochemical, molecular, histological and immunohistochemical examination. The blood serum of every animal was used for the determination of the activities of transaminases (ALT and AST) and alkaline phosphatase. Serum phosphate levels, direct and indirect bilirubin and protetein (albumin and total globulins) were determined. For the determination of liver regeneration, a portion of the excised liver was used for the determination of thymidinokinase activity and immunohistochemical expression of Ki-67. In addition, samples were pathologically examined under hematoxylin-eosin staining, photographic images were taken and morphometric analysis was performed with the help of specialized software. The distance between central vein and portal spaces and the axes (major, minor), the Feret diameter, the area and the perimeter of the central vein were determined. Post isolation of total RNA from liver tissue, m-RNA expression of VEGF isoforms (VEGF120, VEGF144, VEGF164 and VEGF188), VEGF receptors (VEGFR1 and VEGFR2), Angiopoietins (Angiopoietin 1 and 2) and angiopoietin receptors (Tie1 and Tie2) was determined with the use of reverse transcription PCR (RT-PCR). Apart from that, the immunohistochemical expression of VEGF, VEGFR1, VEGFR2, Ang1 and Tie2 was determined for every group. Finally, protein expression of VEGFR2 was examined with Western blotting...

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Ο VEGF παίζει σημαντικό ρόλο σε όλα τα εξεταζόμενα στάδια της ηπατικής αναγέννησης που προκαλείται από την ηπατοτοξική δράση της ακεταμινοφαίνης. Η ανίχνευσή του στο φυσιολογικό ήπαρ αποτελεί ενδεικτικό γεγονός της συμμετοχής του στην ομοιόσταση των αγγείων. Ανιχνεύεται, επίσης σε αυξημένα επίπεδα στις 24 ώρες μετά τη χορήγηση, γεγονός ενδεικτικό της σημασίας του ως προφλεγμονώδη παράγοντα, αλλά και στις 72 ώρες ως παράγοντα που συμμετέχει στην αναγεννητική διαδικασία. Τέλος, εντοπίζεται σε αυξημένα επίπεδα στις 240 ώρες, με μεταβολές και της επιμέρους έκφρασης των ισομορφών του, δηλαδή παρατηρείται αύξηση του m-RNA του VEGF120 έναντι του m-RNA του VEGF164, γεγονός ενδεικτικό της συμμετοχής του παράγοντα και στην αναδιάταξη του ηπατικού παρεγχύματος μετά το πέρας της αναγεννητικής διαδικασίας. Η εξέταση της έκφρασης των ισομορφών του επέτρεψε και την ανάδειξη της διακριτής βιολογικής τους σημασίας, με την ισομορφή VEGF188 να έχει σημαντικό ρόλο στα αρχικά στάδια, την ισομορφή VEGF164 στη φλεγμονώδη αντίδραση και την αναγεννητική διαδικασία και την ισομορφή VEGF120 στην διαδικασία αναδιάταξης του παρεγχύματος. Το m-RNA του υποδοχέα VEGR1 αυξήθηκε στις 24 ώρες του VEGFR2 στις 24 και 96 ώρες ανάλογα με τα επίπεδα του VEGF. Η αύξηση του VEGF120 στους όψιμους χρόνους συνοδεύεται από αύξηση του VEGFR2 στις 144 ώρες και στις 240 ώρες γεγονός που επιβεβαιώνει τη σημασία της δράσης της ισομορφής στους όψιμους χρόνους. Ως προς τις αγγειοποιητίνες και τους υποδοχείς τους, η αύξηση του m-RNA των αγγειοποιητινών, η εντόπιση τους στην κεντρολοβιδιακή περιοχή, η αύξηση των επιπέδων m-RNA του υποδοχέα Tie2 και η εντόπισή του στα φλεγμονώδη κύτταρα που αναπτύσσονται στις 24 ώρες ως προς την κεντρολοβιδιακή περιοχή, καθιστούν, βάσει της υπάρχουσας βιβλιογραφίας, το συγκεκριμένο μοντέλο το πρώτο in vivo μοντέλο που επιβεβαιώνει ότι φλεγμονώδη κύτταρα εκφράζουν τον Tie2 ενώ αναδεικνύει και το ρόλο του 423 συστήματος Ang-Tie στην φλεγμονώδη αντίδραση και την έναρξη της ηπατικής αναγέννησης. Η έκφραση σε επίπεδο m-RNA και ανοσοϊστοχημικά στους όψιμους χρόνους, επιβεβαιώνει τόσο τη σημασία του συστήματος στην αναδιάταξη του ηπατικού παρεγχύματος, αλλά και την συμπληρωματικότητα που υπάρχει με τον VEGF και τους υποδοχείς του...