Μελέτη της μοριακής διαταραχής του φαινοτύπου της οικογενούς υπερχοληστερολαιμίας (FH) στον ελληνικό πληθυσμό: γονίδια LDL-R, APOB-100, PSCK9, και ARH

Abstract

Atherosclerosis constitutes the fundamental cause of cardiovascular diseases, such as infarction, angina pectoris and vasal cerebral episodes. Hypercholesterolemia is the main cause for the 30-50% cardiovascular diseases, which constitute the main cause of death of young in most developed countries and are accountable for up to 50% of deaths. The illness begins from childhood and develops during adulthood. Many studies have shown that the risk factors that contribute to the development of atherosclerosis are distinguished in lipidaimic and not lipidaimic factors. Lipidaemic risk factors that contribute to the development of atherosclerosis are: increased total cholesterol (TC), increased levels of triglycerides (TG), low density cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein (LDL-C) Familial hypercholesterolemia is a common disease that is presented in 1% of adults and is considered to be responsible for 10% of early events of illness. Children with inherited defects in lipid metabolism and particularly in the gene encoding the LDL receptor are characterised as heterozygotes with a frequency of 1:500. They present levels of total cholesterol TC > 200 mg/dl and develop cardiovascular diseases in the adult life. Homozygous children are presented with a frequency of 1:1.000.000. The levels of total cholesterol range from 500 to 2000 mg/dl while clinically present tendon xanthomas up to the age of 5 years, corneal arcus as well as severe damage of coronary arteries up to the age of 20 years. Aim of my work is to study of Greek patients expressing the phenotype of familial hypercholesterolemia, with positive family history. Exclusion of any mutation in the LDL-R gene will lead to the analysis of the ApoB-100 gene for the 3 most frequent mutations, R3500Q, R3500W, and R3531C In the case that the study of ApoB100 mutations is negative then the third phase of the study was performed on the new gene, PCSK9 follows. The patients with phenotypical ADH and with a positive family history and no mutations in the genes of LDL-R and ApoB-100, will constitute our inquiring material for likely mutations in PCSK9 gene, for the first time in Greece. The detection of possible mutations in this gene will be done by PCR and sequencing. Firstly, we will focus on the four most frequent mutations in the gene and afterwards, if no mutations are found, we will amplify all the exons by PCR and after sequencing of the whole gene our interest will be focused on new mutations In addition, studies have shown that from the 311 polymorphisms of PCSK9 detected up to date some are associated with high and others with low levels of lipids, a fact that can characterize these genetic indicators as cardioprotective or not. So we will study 9 polymorphisms of the PCSK9 gene. For the first time in Greece the R3500Q mutation apoB100 gene was detected in a child while mutations in PCSK9 do not constitute a fundamental cause of familial hypercholesterolemia in Greece. The identification of polymorphisms showed that indeed the A53V, rs 615563, rs 644000 are associated with levels of lipids, A53V is associated with high levels of HDLc and can be considered as cardioprotective.

Η αθηρωμάτωση, αποτελεί βασική αιτία εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων, όπως έμφραγμα, στηθάγχη και αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια. Η υπερχοληστερολαιμία ενοχοποιείται για το 30-50% των καρδιαγγειακών νοσημάτων, τα οποία αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου των ενηλίκων στις περισσότερες ανεπτυγμένες χώρες και ευθύνονται για ποσοστό έως και 50% περίπου του συνόλου των θανάτων. Η νόσος αρχίζει από την παιδική ηλικία και εξελίσσεται κατά την ενήλικο ζωή. Μεγάλες μελέτες έχουν δείξει ότι οι επιβαρυντικοί παράγοντες που συμβάλλουν στη διεργασία της αθηροσκλήρωσης διακρίνονται σε λιπιδαιμικούς και μη λιπιδαιμικούς. Επιβαρυντικοί παράγοντες που συμβάλλουν στη διεργασία της αθηροσκλήρωσης: αυξημένη ολική χοληστερόλη (TC), αυξημένα τριγλυκερίδια (TG), χαμηλή υψηλής πυκνότητας χοληστερόλη (HDL-C), υψηλή χαμηλής πυκνότητας χοληστερόλη (LDL-C) Η οικογενής υπερχοληστερολαιμία είναι μία κοινή διαταραχή που συναντάται σε ποσοστό 1% των ενηλίκων και θεωρείται υπεύθυνη για το 10% των πρώιμων εκδηλώσεων της νόσου. Παιδιά με κληρονομούμενη βλάβη στον μεταβολισμό των λιπιδίων και ιδιαίτερα στο γονίδιο του LDL υποδοχέα εμφανίζονται ως ετεροζυγώτες με συχνότητα 1:500. Παρουσιάζουν τιμές ολικής χοληστερόλης (ΤC) >200 mg/dl και εκδηλώνουν καρδιαγγειακά νοσήματα στην ενήλικο ζωή. Παιδιά ομοζυγώτες εμφανίζονται με συχνότητα 1:1.000.000. Τα επίπεδα ολικής χοληστερόλης (ΤC) κυμαίνονται από 400 έως 1000 mg/dl ενώ κλινικά εμφανίζουν τενόντια ξανθώματα μέχρι την ηλικία των 5 ετών, καθώς και σοβαρές βλάβες των στεφανιαίων αρτηριών μέχρι την ηλικία των 20 ετών. Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη Ελλήνων ασθενών με τον φαινότυπο της οικογενούς υπερχοληστερολαιμίας και με θετικό οικογενειακό ιστορικό. Απόκλειση οποιασδήποτε μετάλλαξης του LDL-R γονιδίου θα οδηγήσει στην ανάλυση του γονιδίου της ApoB-100 για τις 3 πιο συχνές μεταλλάξεις, R3500Q, R3500W, και R3531C. Εφόσον, η παραπάνω μελέτη αποβεί αρνητική, τότε θα ακολουθήσει η τρίτη φάση της μελέτης για το νέο γονίδιο, PCSK9. Άρα οι ασθενείς με φαινότυπο ADH και με θετικό οικογενειακό ιστορικό στους οποίους δεν υπάρχει μετάλλαξη στα γονίδια του LDL-R και της ApoB-100, θα αποτελέσουν το ερευνητικό μας υλικό για πιθανή μετάλλαξη στο γονίδιο PCSK9, που επίσης θα γίνει για πρώτη φορά στην Ελλάδα. Η ανίχνευση κάποιας μετάλλαξης αυτού του γονιδίου θα γίνει με την PCR και τον άμεσο προσδιορισμό αλληλουχίας. Σε πρώτη φάση θα ανιχνευτούν οι τέσσερις πιο συχνές μεταλλάξεις του νέου γονιδίου και στη συνέχεια, αν δεν εντοπιστούν, θα πολλαπλασιάστούν όλα τα εξόνια του γονιδίου με PCR και θα εντοπιστούν κάποιες νέες μετάλλαξεις με τον άμεσο προσδιορισμό αλληλουχίας. Τέλος, θα ταυτοποιηθούν 9 πολυμορφισμοί του PCSK9 αφού μελέτες έχουν δείξει ότι από τους 311 ανιχνευθέντες μέχρι σήμερα κάποιοι συσχετίζονται με υψηλά και άλλοι με χαμηλά επίπεδα λιπιδίων, γεγονός που μπορεί να χαρακτηρίσει τους γενετικούς αυτούς δέικτες καρδιοπροστατευτικούς και μη. Για πρώτη φορά στην Ελλάδα ανιχνεύτηκε μετάλλαξη ApoB100, η R3500Q, σε παιδί ενώ οι μεταλλάξεις του PCSK9 δεν αποτελούν βασική αιτία της οικογενούς υπερχοληστερολαιμίας για την Ελλάδα. Η ταυτοποίηση των πολυμορφισμών έδειξε ότι πράγματι οι A53V, rs 615563, rs 644000 συσχετίζονται με επίπεδα λιπιδίων από τους οποίους ο A53V συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα HDLc και μπορεί να θεωρηθεί καρδιοπροστατευτικός.