Μελέτη των γενετικών επιδράσεων επιλεγμένων παραγόντων του επαγγελματικού περιβάλλοντος σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro

Abstract

The study of genotoxic potential of a variety of chemical and physical agents via the application of various in vitro methodologies constitutes one of the stages for the evaluation of implication to human health. The widely used chemicals agents hydroquinone and glutaraldehyde were selected in this PhD thesis since (a) human exposure may occur through the occupational environment, (b) the data regarding their genotoxic and carcinogenic effect are conflicting, and (c) they can be found in occupational environments (i.e. radiological laboratories, hospitals) where exposure to ionising radiation may occur. The methodologies were microscopic analysis of chromosome aberrations and SCEs, karyotypic analysis, cell survival staining methods using Neutral Red, flow cytometric analysis, Premature chromosome condensation (PCC) methodology using chemical induction and cellular fusion, G2-chromosomal radiosensitivity assay. The results have shown the genotoxic effects of hydroquinone and glutaraldehyde in peripheral blood lymphocyte cultures of healthy donors in vitro and the concentrations in which this action is practiced were determined. It was shown for the first time that non-acutely toxic doses of the chemical agents hydroquinone and glutaraldehyde enhances the radiation-induced chromosomal damage of peripheral blood lymphocytes of healthy donors and the precise mechanism via which this action is practiced was shown. Glutaraldehyde exerts its action by increasing the initial yield of radiation-induced chromosomal damage without affecting cell-cycle kinetics or the repair rate of chromosomal damage (see Hatzi et al. 2008, Mutagenesis). Hydroquinone exerts its action by inducing a less efficient G2-M-checkpoint after irradiation, facilitating thus the progression of damaged cells from G2- to M-phase (see Hatzi et al. 2007, International Journal of Oncology). Regarding the combination of methodologies that were developed and applied it was shown that chromosomal analysis at metaphase using conventional cytogenetics underestimates the genotoxic effect of chemicals that induce temporal arrest in the G2-phase. The chemically induced PCC method allows the analysis of chromosomal changes such as chromosome and chromatid type aberrations in the G2-phase as well as any effect on cell cycle progression as a result of exposure to genotoxic agents. The PCC method via cellular fusion immediately allows the direct analysis of chromosomal damage after exposure to genotoxic agents as well as the monitoring of the repair rate of chromosomal damage (see Hatzi et al. 2006, Scientific World Journal). The G2-chromosomal radiosensitivity method in combination with in vitro exposure of lymphocyte cultures to chemical agents is proposed as a valuable cytogenetic method to study the combined effect of chemical agents with ionising radiation and also as a permissive tool to correlate the possible genotoxic effect of a chemical on individual endogenous radiosensitivity.

Η ανάγκη αποσαφήνισης του μηχανισμού της γονοτοξικής δράσης χημικών και φυσικών παραγόντων του επαγγελματικού περιβάλλοντος μέσω εφαρμογής ευαίσθητων μεθοδολογιών είναι αυξημένη δεδομένου ότι η έκθεση σε γονοτοξικούς παράγοντες και η επακόλουθη βλάβη στο γενετικό υλικό κλιμακώνουν τον κίνδυνο καρκινογένεσης. Η ευρεία χρήση των χημικών παραγόντων υδροκινόνη και γλουταραλδεΰδη, τα αντικρουόμενα βιβλιογραφικά δεδομένα αναφορικά με τη γονοτοξική και καρκινογόνο δράση τους καθώς και η χρήση τους σε επαγγελματικό περιβάλλον (π.χ. ακτινολογικά εργαστήρια) όπου μπορεί να υπάρξει και έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία μας οδήγησαν στην επιλογή της μελέτης των χημικών αυτών παραγόντων τόσο μεμονωμένα όσο και σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων υγιών δοτών in vitro. Οι μεθοδολογίες που εφαρμόστηκαν ήταν ανάλυση χρωμοσωματικών αλλοιώσεων και SCEs στη μετάφαση, καρυοτυπικός έλεγχος, έλεγχος κυτταρικής βιωσιμότητας με χρώση Neutral Red, κυτταρομετρία ροής, μέθοδος της πρόωρης χρωμοσωματικής συμπύκνωσης (PCC) μέσω χημικής επαγωγής καθώς και μέσω κυτταρικής σύντηξης, μέθοδος της G2-χρωμοσωματικής ακτινοευαισθησίας. Στα αποτελέσματα, δείχθηκε η γονοτοξική δράση της υδροκινόνης και της γλουταραλδεΰδης σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro και καθορίστηκαν οι συγκεντρώσεις στις οποίες η δράση αυτή ασκείται. Δείχθηκε για πρώτη φορά πως μη-γονοτοξικές δόσεις των χημικών αυτών παραγόντων ενισχύουν την ακτινοπροκληθείσα χρωμοσωματική βλάβη Τ-λεμφοκυττάρων και προσδιορίστηκε ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου η δράση αυτή ασκείται. Η γλουταραλδεΰδη ασκεί τη δράση της στην ενίσχυση της ακτινοπροκληθείσας χρωμοσωματικής βλάβης επιδρώντας στην αρχική χρωμοσωματική βλάβη που προκαλείται αμέσως μετά την ακτινοβόληση (βλ. Hatzi et al. 2008, Mutagenesis). Η υδροκινόνη ασκεί τη δράση της επιδρώντας στη λειτουργικότητα του G2/M σημείου ελέγχου, και την εν μέρει απενεργοποίηση του, επιτρέποντας μεγαλύτερο αριθμό ακτινοβολή μένων και αλλοιωμένων κυττάρων να μεταβαίνει από τη G2-φάση στη μετάφαση (βλ. Hatzi et al. 2007, International Journal of Oncology). Αναφορικά με τη μεθοδολογία που αναπτύχθηκε, δείχθηκε πως η γονοτοξική δράση χημικών παραγόντων με την κλασική προσέγγιση χρωμοσωματικής ανάλυσης στη μετάφαση υποεκτιμάται σε περιπτώσεις χημικών παραγόντων που επάγουν καθυστέρηση στον κυτταρικό κύκλο. Η χημικά επαγόμενη μέθοδος PCC, που επιτρέπει την ανάλυση των χρωμοσωματικών αλλαγών στη G2-φάση του κυτταρικού κύκλου, αποδεικνύεται περισσότερο ευαίσθητη από τη μέθοδο κλασσικής χρωμοσωματικής ανάλυσης στη μετάφαση και προτείνεται ως ένα αξιόπιστο εργαλείο για την εκτίμηση της δράσης χημικών παραγόντων στον κυτταρικό κύκλο. Η μέθοδος PCC διαμέσω κυτταρικής σύντηξης αποδεικνύεται ιδιαίτερα χρήσιμη δεδομένου ότι επιτρέπει αφενός την ανάλυση της χρωμοσωματικής βλάβης αμέσως μετά την έκθεση σε γονοτοξικούς παράγοντες και αφετέρου την παρακολούθηση της επιδιόρθωσης της βλάβης αυτής (βλ. Hatzi et al. 2006, Scientific World Journal). Η μέθοδος της G2-χρωμοσωματικής ακτινοευαισθησίας σε συνδυασμό με in vitro έκθεση σε χημικά προτείνεται ως μεθοδολογία μελέτης συνδυασμένης δράσης χημικών παραγόντων και ακτινοβολιών αλλά και συσχέτισης της γονοτοξικής δράσης χημικών παραγόντων με την ενδογενή ακτινοευαισθησία.