Συγκριτική μελέτη του μηχανισμού σχηματισμού αερεγχύματος στις επίκτητες ρίζες του καλαμποκιού υπό συνθήκες τροφοπενίας αζώτου, φωσφόρου ή θείου

Abstract

Aerenchyma formation is a mechanism that occurs in maize roots not only under oxygen deprivation but also under sulfate, phosphate or nitrate deprivation. This thesis focused in a comparative study of aerenchyma formation under these deprivations so as to examine whether or not this mechanism differs among these treatments. Putting forward this, we examined: 1. the spatial and temporal allocation of aerenchyma in the 1st whorl of adventitious roots. The 1st whorl of adventitious roots was selected as the target organ because emergence of these roots coincided with the beginning of the deprivation, 2. the alterations of the energy status of the root in each treatment, focusing our interest in the oxygen consumption and the ATP levels, 3. the signal transduction pathway leading to aerenchyma formation by looking into the hydrogen peroxide levels and the allocation of reactive oxygen species, peroxidase and calcium. Furthermore, the nucleus condition plus the transcription activity were examined as well as the autophagy process and the role of some effectors in the aerenchyma formation process, 4. the alterations of the primary cell wall’s composition by measuring cellulase and polygalacturonase activity and analyzing the distribution of the following structural components: pectins (homogalacturonans and rhanmogalacturonans I) as well as their esterification degree, proteins (extensins and arabinogalacturonan) and cellulose. Our results revealed that the start time, location and extent of aerenchyma formation differed depending upon the specific deprivation. P-deprivation (-P) produced aerenchyma to the least extent, while N-deprivation (-N) to the greatest, with S-deprivation (-S) in between. Aerenchyma was not observed in the root base but in the region of emerging or developing lateral roots. Compared with control, the deprivations were characterized by higher oxygen consumption and lower ATP concentration, indicating a perturbation in the energetics of the root. Reactive oxygen species had a dual role in aerenchyma formation acting as signals and executors. Ethylene seemed not to be implicated in the aerenchyma formation in contrast with hypoxia. IP₃ also did not act as a transductor in this pathway. In contrast, extracellular calcium was implicated in aerenchyma formation. Autophagy process which was observed in all three deprivations included tonoplast rapture while mitochondria were the last organelles that collapsed. Aerenchyma formation seemed to be related with alterations in the primary cell wall’s composition. The esterification degree of pectins showed increment. The peaks of cellulase activity, which were located between days 3 (-N) and 6 (-P), taken together with the respective alterations in polygalacturonase activity indicated a coordination which preceded aerenchyma formation. Their combination characterized the deprivation and might explain the intensity of the process. Finally, aerenchyma formation process can be distinguished into three major processes: the activation process, the execution process and the dissemination and termination process.

Εκτός από την δημιουργία αερεγχύματος στις ρίζες του καλαμποκιού υπό συνθήκες έλλειψης οξυγόνου στο υπόστρωμα, αερέγχυμα σχηματίζεται και στις περιπτώσεις τροφοπενίας αζώτου ή φωσφόρου ή θείου. Η εργασία εστιάστηκε στη συγκριτική μελέτη αυτού του φαινομένου, προκειμένου να εντοπίσει ομοιότητες και διαφορές και να τις αναλύσει. Το ριζικό σύστημα του καλαμποκιού είναι σύνθετο και επιλέχθηκαν για μελέτη οι βλαστογενείς ρίζες 1ης σειράς (ή πρώτου κόμβου) επειδή εμφανίζονται την 7η ημέρα και έτσι αντιμετωπίζουν την έλλειψη από το ξεκίνημα της έκπτυξής τους, σε αντίθεση με τις πρωτογενείς και τις δευτερογενείς εμβρυακές οι οποίες είναι ήδη ανεπτυγμένες κατά την έναρξη της τροφοπενίας. Η παρουσία πλαγίων ριζών είναι χαρακτηριστικό της ρίζας το οποίο ήταν ενδεχόμενο να σχετίζεται με την ανάπτυξη του αερεγχύματος, γι’ αυτό η συγκριτική μελέτη της κατανομής του αερεγχύματος έγινε σε συνδυασμό με την παρουσία των πλαγίων ριζών. Τα ευρήματα ομαδοποιούνται σε τρεις ενότητες. Στην 1η ενότητα αναλύονται οι επιδράσεις των ελλείψεων θείου, αζώτου και φωσφόρου στο μήκος της βλαστογενούς ρίζας, στην κατανομή του αερεγχύματος και στα ενεργειακά της ρίζας (στην κατανάλωση οξυγόνου της βλαστογενούς και στο επίπεδο του ΑΤΡ) και συσχετίζεται η κατανομή του αερεγχύματος, της κατανάλωσης οξυγόνου και του ποσοστού των επιμέρους τμημάτων της βλαστογενούς. Στη 2η ενότητα διερευνάται η μεταγωγή του σήματος που οδηγεί σε δημιουργία αερεγχύματος υπό την επίδραση των συγκεκριμένων ελλείψεων και αναλύονται συγκριτικά οι επιδράσεις στο επίπεδο του υπεροξειδίου του υδρογόνου, στην κατανομή των ενεργών μορφών οξυγόνου στα παρεγχυματικά κύτταρα της βλαστογενούς στο ακρορρίζιο, 1cm από την καλύπτρα, στο τμήμα των αναδυόμενων πλαγίων ριζών (ELR), στο τμήμα των αναπτυσσόμενων πλαγίων ριζών (LR) και στη βάση για κάθε τροφοπενία, στην κατανομή της υπεροξειδάσης στα κυτταρικά τοιχώματα των παρεγχυματικών κυττάρων των διαφόρων τμημάτων της βλαστογενούς για την κάθε τροφοπενία, στην κατανομή του ασβεστίου στα κύτταρα του παρεγχύματος της βλαστογενούς για κάθε τροφοπενία, στην κατάσταση των πυρήνων και στην μεταγραφική δραστηριότητα των παρεγχυματικών κυττάρων του ακρορριζίου, στην κατανομή της καλλόζης και στην διαδικασία της αυτοφαγίας, καθώς και η επίδραση των τροποποιητών του μονοπατιού μεταγωγής σήματος για σχηματισμό αερεγχύματος στην κάθε τροφοπενία. Στην 3η ενότητα αναλύονται οι τροποποιήσεις της σύστασης του πρωτογενούς κυτταρικού τοιχώματος σε σχέση με τον σχηματισμό του αερεγχύματος και περιγράφεται η συγκριτική επίδραση της κάθε τροφοπενίας στην δραστηριότητα της κυτταρινάσης και στην δραστηριότητα της πολυγαλακτουρονάσης σε επίπεδο ολόκληρης βλαστογενούς ρίζας. Ακολουθεί η κατανομή των δομικών συστατικών του πρωτογενούς κυτταρικού τοιχώματος στις περιοχές εκτός κεντρικού κυλίνδρου στα διάφορα τμήματα της βλαστογενούς για κάθε τροφοπενία. Αναλύεται η κατανομή του βαθμού εστεροποίησης των πηκτινών με το ερυθρό του ρουθηνίου, η κατανομή των μη-εστεροποιημένων και χαμηλού ποσοστού εστεροποιημένων ομογαλακτουρονανών, η κατανομή των εστεροποιημένων ομογαλακτουρονανών υψηλού ποσοστού εστεροποίησης, η κατανομή των ραμνογαλακτουρονανών I, η κατανομή των εξτενσινών, η κατανομή των αραβινογαλακτανο-πρωτεϊνών και η κατανομή της κυτταρίνης. Στα αποτελέσματα που αφορούν σε εντοπισμούς in situ, δίνεται η πρωτότυπη εικόνα και στη συνέχεια αναλύεται με την χρήση ενός συστήματος βαθμονόμησης σε αυθαίρετη κλίμακα ή με άλλο τρόπο στην περίπτωση των ενεργών μορφών οξυγόνου προκειμένου να διευκολυνθεί η συγκριτική μελέτη και η κατανόηση των διαφοροποιήσεων με εποπτικό τρόπο. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων που αφορούν την χαρτογράφηση του αερεγχύματος, προκύπτει ότι ο χρόνος εμφάνισης, η περιοχή ανάπτυξης καθώς και η έκταση ανάπτυξης αερεγχύματος διαφοροποιούνταν μεταξύ των ελλείψεων. Η έλλειψη φωσφόρου παρουσίασε το λιγότερο αερέγχυμα, ενώ η έλλειψη αζώτου το περισσότερο αερέγχυμα, με τα φυτά -S να χαρακτηρίζονται από μία ενδιάμεση κατάσταση. Και στις τρεις περιπτώσεις το αερέγχυμα δεν εμφανίζεται στην βάση της ρίζας γεγονός που υποδηλώνει ότι η διευκόλυνση της διακίνησης των αερίων μεταξύ υπέργειου και υπόγειου μέρους του φυτού δεν φαίνεται να είναι ο κύριος λόγος για τον οποίο σχηματίζεται, όπως έχει αναφερθεί ότι συμβαίνει στην περίπτωση της υποξίας. Η ένταση και η έκταση του τροφοπενικού αερεγχύματος διαφοροποιείται ανάλογα με την τροφοπενία. Η συγκέντρωση του ΑΤΡ έδειξε διαταραχές από τις πρώτες κιόλας ημέρες. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επιβολή θρεπτικής ανεπάρκειας ενεργοποιεί κάποιο μηχανισμό σκανδάλης για τον σχηματισμό αερεγχύματος, με το ΑΤΡ πιθανά σε σημαντικό ρόλο. Μετρήθηκε και η κατανάλωση οξυγόνου για να υπάρξει εικόνα της ενεργειακής κατάστασης της ρίζας σε συνδυασμό με τα επίπεδα του ΑΤΡ και βρέθηκε ότι στο επίπεδο της ολόκληρης ρίζας οι τιμές της κατανάλωσης οξυγόνου ήταν υψηλότερες και στις τρεις ελλείψεις σε σχέση με τους μάρτυρες. Φαίνεται ότι το τροφοπενικό αερέγχυμα χαρακτηρίζεται από μείωση της στάθμης του ΑΤΡ και αύξηση της κατανάλωσης οξυγόνου την ημέρα 2, σε σύγκριση με τα φυτά μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει διαταραχές του ενεργειακού μεταβολισμού της τροφοπενικής ρίζας και προτείνεται ότι αυτές οι διαταραχές στο ΑΤΡ καθώς και στην κατανάλωση οξυγόνου δηλώνουν μεταβολές στην ενεργειακή κατάσταση και παίζουν ρόλο εκκινητή του τροφοπενικού αερεγχύματος. Διερευνήθηκε ο ρόλος των ενεργών μορφών οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) και στις τρεις τροφοπενίες προκειμένου να δειχθεί ότι οι ενεργές μορφές οξυγόνου συμμετέχουν στην σηματοδότηση για τον σχηματισμό τροφοπενικού αερεγχύματος. Παρατηρήθηκε ότι υπάρχουν δύο περιπτώσεις όπου εντοπίζονται τα ROS και προτείνεται ότι τα ROS μπορούν να λειτουργήσουν με διπλό ρόλο στην περίπτωση του τροφοπενικού αερεγχύματος, τόσο ως σήμα (ROS₁) όσο και ως εκτελεστές (ROS₂) στην πορεία της ανάπτυξης του φαινομένου. Ο δεύτερος ρόλος των ενεργών μορφών οξυγόνου ως εκτελεστών ενισχύεται και από την παρουσία δραστηριότητας υπεροξειδάσης στα σπασμένα κυτταρικά τοιχώματα στις περιοχές ύπαρξης αερεγχύματος. Από την ενότητα των αποτελεσμάτων χρήσης των παρεμποδιστών προκύπτει ότι στο ακρορρίζιο των φυτών μαρτύρων τα ROS είναι κυρίως υπεροξείδιο του υδρογόνου. Από την ανάλυση των δεδομένων του ασβεστίου συμπεραίνεται ότι το ασβέστιο που δείχνει η χρωστική αυτή είναι πιθανότερο να είναι ελεύθερο ασβέστιο που λειτουργεί ως σήμα. Επειδή το αιθυλένιο αποτελεί μόριο κλειδί κατά τον σχηματισμό αερεγχύματος στις ρίζες καλαμποκιού υπό συνθήκες υποξίας, εξετάστηκε κατά πόσο η μεταγωγή σήματος αιθυλενίου εμπλέκεται στην διαδικασία του τροφοπενικού αερεγχύματος. Και στις τρεις τροφοπενίες, παρουσία AVG στο υπόστρωμα το αερέγχυμα εμφανίστηκε στο μέσο της ρίζας. To AVG (aminoethoxyvinylglycine) μπλοκάρει την δράση της συνθάσης του 1- αμινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικού οξέος (1-amino-cyclopropane-1-carboxylate, ACC) παρεμποδίζοντας την βιοσύνθεση του αιθυλενίου, επομένως η εμφάνιση του αερεγχύματος αποδεικνύει ότι η διαδικασία δεν εξαρτάται από το αιθυλένιο. Παρουσία νεομυκίνης (η οποία μπλοκάρει την παραγωγή τριφωσφορυλιωμένης ινοσιτόλης, ΙΡ₃), ή ερυθρού του ρουθηνίου (το οποίο μπλοκάρει την δράση των ενδομεμβρανικών καναλιών ασβεστίου παρεμποδίζοντας την χρήση των αποθεμάτων του ενδοκυτταρικού ασβεστίου) σχηματίστηκε επίσης αερέγχυμα και στις τρεις ελλείψεις. Αντίθετα όταν στο υπόστρωμα προστέθηκε καφεΐνη (η οποία αυξάνει το ενδοκυτταρικό ασβέστιο ανοίγοντας κανάλια ασβεστίου) παρατηρήθηκε ότι εξωκυτταρικό ασβέστιο ενδεχομένως να απαιτείται για τον σχηματισμό του αερεγχύματος, αφού στην περίπτωση αυτή αερέγχυμα παρατηρήθηκε ακόμα και στην βάση της ρίζας. Συμπεραίνεται ότι για τον σχηματισμό τροφοπενικού αερεγχύματος ακολουθείται διαφορετικό μονοπάτι μεταγωγής σήματος στο οποίο δεν εμπλέκεται το αιθυλένιο, συγκριτικά με τα αποδεκτά για το υποξικό αερέγχυμα. Η τριφωσφορυλιωμένη ινοσιτόλη (inositol triphosphate, ΙΡ₃) δεν είναι μεταγωγός, ενώ το ασβέστιο που παίζει ρόλο είναι εξωκυτταρικό. Εξετάζοντας την συνδυαστική δράση καφεΐνης & τροφοπενίας παρατηρήθηκε ότι σχηματίζεται αερέγχυμα και στην βάση όπου στην περίπτωση μόνης της τροφοπενίας δεν σχηματίζεται. Η μόνη περίπτωση όπου παρατηρείται αυτό είναι υπό συνθήκες υποξίας όπου πρέπει να μεταφερθεί οξυγόνο από το υπέργειο τμήμα του φυτού στην ρίζα. Επισημαίνεται ότι από τα μόρια που προστέθηκαν στο τροφοπενικό θρεπτικό διάλυμα, το ερυθρό του ρουθηνίου και η καφεΐνη επηρέασαν και το μήκος της ρίζας σημαντικά και συγκεκριμένα το ερυθρό του ρουθηνίου μείωσε το μήκος της ρίζας, ενώ η καφεΐνη το αύξησε. Αυτό σημαίνει ότι το ασβέστιο ως κοινός μεταγωγός φαίνεται να αποτελεί τον κόμβο που επηρεάζει τις διαδικασίες που μελετήθηκαν. Το αερέγχυμα περιλαμβάνει προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Έτσι μελετήθηκε η διαδικασία της αυτοφαγίας υπό την κάθε έλλειψη με σκοπό να εντοπιστούν διαφορές και ομοιότητες. Και στις τρεις περιπτώσεις σημεία αυτοφαγίας εντοπίστηκαν την ημέρα 6 σε απόσταση 1 cm από το ακρορρίζιο, ενώ στο ακρορρίζιο μόνο η έλλειψη αζώτου έδειξε μεταβολές σε οργανίδια που οφείλονται στην αυτοφαγία. Παρατηρήθηκε ρήξη του τονοπλάστη σε αυτές τις περιπτώσεις. Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε ότι τα μιτοχόνδρια είναι τα οργανίδια που αποδομούνται τελευταία. Χρησιμοποιήθηκε η χρώση με acridine orange για να εντοπιστούν διαφορές στην κατάσταση των πυρηνών υπό τις τρεις ελλείψεις και η σειρά επιδείνωσης της κατάστασης ήταν -N>-S>-P>C που βρίσκεται σε συμφωνία με την ένταση του αερεγχύματος. Η παρουσία αερεγχύματος φαίνεται να σχετίζεται με την αλλαγή στη σύσταση του πρωτογενούς κυτταρικού τοιχώματος (ΠΚΤ). Για την μελέτη της αποδόμησης του ΠΚΤ μετρήθηκαν και οι δραστηριότητες κυτταρινάσης, πηκτινεστεράσης και πολυγαλακτουρονάσης. Και στις τρεις μεταχειρίσεις υπήρχαν κοινά σημεία όσον αφορά την κυτταρινάση. Δραστηριότητα πηκτινεστεράσης δεν εντοπίστηκε, πιθανόν γιατί έχει ολοκληρωθεί η σχετική διαδικασία από πολύ νωρίς. Ο χρονισμός των δραστικοτήτων κυτταρινάσης και πολυγαλακτουρονάσης δείχνει να έρχεται σε συμφωνία με την εμφάνιση του αερεγχύματος. Όσον αφορά στο ποσοστό εστεροποίησης που εντοπίζεται με το ερυθρό του ρουθηνίου προκύπτει ότι υπάρχει αύξηση του βαθμού εστεροποίησης στις μεταχειρίσεις σε σχέση με τα φυτά μάρτυρες. Χαμηλότερο ποσοστό εστεροποίησης εντοπίζεται στα κύτταρα της ενδοδερμίδας ανεξάρτητα από την τροφοπενία και το τμήμα της ρίζας. Στα τμήματα ELR και LR υπάρχει μείωση του βαθμού εστεροποίησης στις μεταχειρίσεις σε αρκετές περιπτώσεις, που σημαίνει δράση πηκτινεστεράσης. Επειδή οι μεταβολές που παρατηρήθηκαν στους βαθμονομικούς πίνακες είναι μικρές, ενώ οι σημαντικές εντοπίζονται σε λίγες, ορισμένες μόνο ανατομικές περιοχές της ρίζας, αυτό φαίνεται να εξηγεί γιατί δεν βρέθηκε δραστηριότητα πηκτινεστεράσης με την προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε. Με τη χρήση των αντισωμάτων παρέχεται εικόνα της κατανομής των εστεροποιημένων τμημάτων των πηκτινικών κλασμάτων του ΠΚΤ και κατά συνέπεια του βαθμού εστεροποίησης του πολυγαλακτουρονικού κλάσματος. Σχετικά με την κυτταρίνη παρατηρείται ότι οι περιπτώσεις όπου ο μάρτυρας υπολείπεται των μεταχειρίσεων είναι περισσότερες σε σχέση με τις πηκτίνες. Όσον αφορά στις εξτενσίνες και τις αραβινογαλακτανο-πρωτεΐνες γενικότερα εντοπίζεται ασθενές σήμα. Προτείνεται ότι ο λόγος σχηματισμού του τροφοπενικού αερεγχύματος σχετίζεται κυρίως με αναδιανομή θρεπτικών συστατικών για την υποστήριξη τόσο των εκπτυσσομένων πλαγίων ριζών όσο και των υπολοίπων κυττάρων της ρίζας που δεν θα λυθούν. Η υπόθεση αυτή καταδεικνύει ένα διαφορετικό ρόλο για το τροφοπενικό αερέγχυμα από τον αντίστοιχο του υποξικού αερεγχύματος, ο οποίος σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία είναι η μεταφορά αερίων από το υπέργειο στο υπόγειο τμήμα του φυτού. Αυτός ίσως και να είναι ο λόγος που και η πορεία σηματοδότησης για την δημιουργία του τροφοπενικού αερεγχύματος δεν φαίνεται να περιλαμβάνει το αιθυλένιο.