Αξιοποίηση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) και της χημειοφωταυγούς ανίχνευσης για τον προσδιορισμό μοριακών δεικτών του καρκίνου του προστάτη σε περιφερικό αίμα

Abstract

Prostate cancer is the most commonly diagnosed neoplasm in men in the Western world. The sensitivity of current staging modalities is inadequate and more than one third of men with clinically localized prostate cancer are found to be understaged at the time of surgery. Recent studies have suggested that both detection and quantification of circulating prostate cancer cells strongly indicate the presence of metastasis.In the present study, the development of two quantitative methods for the mRNA determination of two specific prostate cancer molecular markers, PSA and PSMA, is described. The simultaneous qualitative detection of both PSA and PSMA mRNA messages in peripheral blood is also reported. The aforementioned tests utilize RT-PCR and a chemiluminometric hybridization assay in a microtiter well-based format.For the PSA mRNA quantification assay, the method includes the construction of a recombinant RNA IS that has the same sequence and primer binding sites as PSA mRNA but differs only in a 24-bp segment. A constant amount of RNA IS is added to the cell lysate prior to RNA isolation. Total RNA from a 5-ml venous blood sample is coextracted with PSA-IS RNA and subjected to RT-PCR. Amplified sequences are labeled with biotin through PCR by using a biotinylated upstream primer. Following heat-denaturation, the biotinylated products (PSA and PSA-IS) are hybridized with oligonucleotide-specific probes that are immobilized on separate microtiter wells. Immobilization of probes is achieved by absorption of their conjugates with BSA. The hybrids are measured using AP- labeled streptavidin and a dioxetane chemiluminogenic substrate. The ratio of the luminescence values obtained for the PSA mRNA and the PSA-IS RNA is a linear function of the initial amount of PSA mRNA present in the sample prior to RT-PCR amplification.The same technique for immobilization of probes is used for the development of the PSA/PSMA hybridization assay. Again total RNA from peripheral blood is subjected to RT-PCR, the biotinylated amplified products (PSA and PSMA) are heat denatured and captured on separate microtiter wells coated with probes specific for each PSA and PSMA target DNA. Addition of strepiavidin-conjugated alkaline phosphatase allows the detection of the hybridization products.As with PSA, the quantitation of PSMA mRNA involves the use of a recombinant RNA IS with similar characteristics. A constant amount of PSMA-IS RNA is added in the reverse transcription mixture. Following RT-PCR, the biotinylated amplified DNA products (PSMA and PSMA-IS) are captured on microtiter wells coated with streptavidin. Immobilized products are then allowed to hybridize to specific alkaline phosphatase- conjugated probes. The hybrids are finally detected by the addition of a dioxetane chemiluminogenic AP substate. The ratio of the luminescence values obtained for PSMA mRNA and PSMA-IS mRNA is linearly related to the initial amount of PSMA mRNA in the sample prior to RT-PCR amplification.In addition, the conjugation chemistry for the covalent coupling of oligonucleotides to proteins is described in detail. Since this chemistry involves more than one reaction steps, optimization conditions for each step are also discussed.As implied by their analytical performance, the proposed methods combine high sensitivity and reproducibility with a wide linear range. Validation of the assays using total RNA extracted from LNCaP cells, a prostate cancer-derived cell line, indicated that as low as 0.5 cancer cell equivalents can be detected from a 5 ml blood sample.From the three methods described above, the first two were also applied to clinical samples from both prostate cancer patients and healthy volunteers. Using the PSA mRNA quantification assay, 50% of the samples from patients with prostate cancer gave results above the detection limit. No PSA mRNA was detected in healthy individuals. On the other hand, the simultaneous detection of PSA and PSMA expression in peripheral blood confirmed the notion that the combined PSA/PSMA assay provides greater sensitivity than PSA or PSMA assay alone in detecting circulating prostatic cells.

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια από τις συχνότερα εμφανιζόμενες μορφές καρκίνου στον ανδρικό πληθυσμό των ανεπτυγμένων χωρών. Η ευαισθησία των σύγχρονων μεθόδων σταδιοποίησης του καρκίνου του προστάτη είναι ανεπαρκής με αποτέλεσμα μεγάλο ποσοστό ασθενών (-40%) που αρχικά διαγνώσθηκαν με εντοπισμένο καρκίνο να βρίσκονται εκ των υστέρων ότι είχαν μετάσταση. Τα τελευταία χρόνια έχει επικρατήσει η άποψη ότι η ανίχνευση καθώς και ο ποσοτικός προσδιορισμός προστατικών καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα αποτελεί ισχυρή ένδειξη ύπαρξης μεταστάσεων.Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη δύο μεθόδων για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA δύο ειδικών προστατικών καρκινικών δεικτών, του PSA και PSMA, σε περιφερικό αίμα. Επιπρόσθετα, παρουσιάζεται μεθοδολογία για την ταυτόχρονη ανίχνευση του mRNA των μορίων αυτών σε περιφερικό αίμα. Όλες οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν βασίζονται στην τεχνική της RT-PCR και σε χημειοφωταυγή ανίχνευση των προϊόντων μέσω δοκιμασίας υβριδισμού σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης.Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA του PSA, η μέθοδος περιλαμβάνει τη χρήση εσωτερικού προτύπου (IS) που διαθέτει τις ίδιες περιοχές σύνδεσης εκκινητών με το mRNA του γονιδίου-στόχου. Τα προϊόντα της RT-PCR (PSA και PSA-IS) έχουν το ίδιο μέγεθος και διαφέρουν μόνο ως προς μια κεντρική αλληλουχία 24 b η οποία και επιτρέπει τελικά τη διάκρισή τους. Από δείγμα ολικού αίματος (5 ml) γίνεται απομόνωση ολικού RNA παρουσία σταθερής ποσότητας PSA-IS RNA και τμήμα του ολικού RNA υποβάλλεται σε RT-PCR. Τα προϊόντα της RT-PCR είναι επισημασμένα με βιοτίνη στο 5' τελικό άκρο τους και δεσμεύονται σε δύο σειρές φρεατίων μέσω υβριδισμού σε συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια (ανιχνευτές). Ακολουθεί προσθήκη στρεπταβιδίνης με ALP και η ανίχνευση των προϊόντων υβριδοποίησης γίνεται με προσθήκη χημειοφωταυγούς υποστρώματος της ALP. Η ακινητοποίηση των ανιχνευτών επιτυγχάνεται μέσω σύζευξής τους με BSA και προσρόφηση της πρωτεΐνης στη στερεή επιφάνεια. Ο λόγος των αναλυτικών σημάτων για το PSA mRNA και το PSA-IS RNA είναι ανάλογος της αρχικής ποσότητας του PSA mRNA στο αρχικό δείγμα.Η ταυτόχρονη ανίχνευση του PSA mRNA και του PSMA mRNA πραγματοποιείται με το ίδιο σύστημα ακινητοποίησης των παραγόμενων DNA τμημάτων μέσω σύζευξης των αντίστοιχων ανιχνευτών με BSA. Ολικό RNA απομονώνεται από το δείγμα, τμήμα αυτού υποβάλλεται σε RT-PCR και τα βιοτινυλιωμένα PSA και PSMA προϊόντα ανιχνεύονται με διαφορετικές δοκιμασίες υβριδισμού με μέτρηση της χημειοφωταύγειας.Όπως και στην περίπτωση του PSA, ο ποσοτικός προσδιορισμός του mRNA του PSMA βασίζεται στην κατασκευή εσωτερικού προτύπου (PSMA-IS RNA) με αντίστοιχα χαρακτηριστικά. Όμως, το PSMA-IS RNA προστίθεται τώρα στο στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής κι όχι της απομόνωσης του ολικού RNA. Μετά από RT-PCR, τα βιοτινυλιωμένα προϊόντα (PSMA και PSMA-IS) ακινητοποιούνται στην επιφάνεια δύο σειρών φρεατίων επικαλυμένων με στρεπταβιδίνη. Ακολουθεί προσθήκη του ανιχνευτή ο οποίος είναι ιχνηθετημένος με ALP και η ανίχνευση των προϊόντων υβριδοποίησης γίνεται με προσθήκη χημειοφωταυγούς υποστρώματος της ALP. Ο λόγος των αναλυτικών σημάτων για το PSMA mRNA και το PSMA-IS RNA συσχετίζεται γραμμικά με την αρχική ποσότητα του PSMA mRNA στο δείγμα.Οι αντιδράσεις σύνθεσης των προϊόντων σύζευξης μεταξύ ολιγονουκλεοτιδίων και πρωτεϊνών που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφονται διεξοδικά. Δεδομένου ότι πρόκειται για πορείες που περιλαμβάνουν περισσότερα του ενός στάδια, αναλύονται οι παράμετροι που βελτιστοποιήθηκαν ώστε το προϊόν σύζευξης να είναι σταθερό και να παρέχει την καλύτερη δυνατή ευαισθησία.Τα αναλυτικά χαρακτηριστικά των προτεινόμενων μεθόδων συνηγορούν στο ότι πρόκειται για μεθόδους με εξαιρετική ευαισθησία, ευρεία γραμμική περιοχή και πολύ καλή επαναληψιμότητα. Η εγκυρότητα κάθε μεθοδολογίας ελέγχθηκε με προσδιορισμό των mRNA των γονιδίων-στόχων σε ολικό RNA από την προστατική καρκινική σειρά, LNCaP. Μέχρι και 1 ισοδύναμο καρκινικό κύτταρο σε 10 mL δείγματος ολικού αίματος ήταν δυνατό να προσδιοριστεί με αξιοπιστία.Η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού του PSA mRNA και η μέθοδος ταυτόχρονης ανίχνευσης των PSA mRNA και PSMA mRNA εφαρμόστηκαν σε δείγματα περιφερικού αίματος ασθενών με καρκίνο του προστάτη και υγιών εθελοντών. Στην πρώτη περίπτωση 50% των δειγμάτων των ασθενών έδωσαν αποτελέσματα πάνω από το όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Κανένα από τα δείγματα υγιών ατόμων δεν έδωσε ανιχνεύσιμο αριθμό καρκινικών κυττάρων. Στη δεύτερη περίπτωση η ανάλυση των κλινικών δειγμάτων επιβεβαίωσε την άποψη ότι σε επίπεδο ανίχνευσης mRNA, η ταυτόχρονη ανίχνευση PSA/PSMA παρέχει υψηλότερη ευαισθησία σε σύγκριση με τη μεμονωμένη ανίχνευση του PSA ή του PSMA.-