Χαρακτηρισμός των απο-ακετυλασών και ακετυλασών που συμμετέχουν στην μεταγραφή του ανθρώπινου γονιδίου της ιντερφερόνης β

Abstract

The ability of cells to sense environmental changes and adapt accordingly, largely depends on the biosynthesis of the appropriate biomolecules. One relevant mechanism with exceptional scientific interest is RNA biosynthesis, especially the type that is responsible for the generation of proteins. Its importance is underscored by the existence of several regulatory and proofreading mechanisms that are dedicated to this purpose. This means that the exact timing, magnitude and fidelity in action of enzymatic mechanisms involved, are strictly controlled parameters. In order to collectively describe all these phenomena, we say that gene expression is subject to regulation. Transcription factors are proteins that play key roles in the regulatory mechanisms. Due to their particular molecular architecture, they are able both to interact specifically with the DNA at sequences called regulatory elements (enhancers, promoters), and to recruit at the template all other proteins that are required for the synthesis of the correct gene product. Recognition of specific bases of DNA in the form of non covalent contacts established by the responsible domain of a transcription factor is not the sole determinant of specificity in gene expression. This is because gene activation, especially in the case of higher organisms, is characterized by extended cooperativity and synergy. Put simply, it is the formation of a higher order nucleoprotein complex on the promoter that is responsible for activation of a given gene, and not the simple binding of one or even a few proteins onto the corresponding regulatory regions of DNA. Assembly of this huge multi-protein complex is promoted by the numerous protein-protein interactions among transcriptional activators, and other proteins, endowed with several tasks related to the correct execution of transcriptional activation process. Thus, the extended allocation of roles to many contributors ensures that promiscuous activation of the gene is practically impossible. On the other hand, the sum of weak but numerous, cooperative interactions among the relevant components is the basis of the intrinsic stability characterizing the rising superstructure. One of the most fundamental differences between bacteria and eukaryotic cells is the existence of chromatin. It is the moiety in which DNA is adopted, along with specialized proteins, in order to become sufficiently compacted and hence easily accommodated within the spatial limits specified by the eukaryotic nucleus. The building block of chromatin is the nucleosome, comprising an octamer of proteins called histones and 147 base pairs of DNA wrapped around it. Formation of nucleosomes and further organization of chromatin into higher-order structures, inevitably leads to the entrapment of critical DNA regulatory sequences within regions exhibiting local configuration that is negative for gene expression. Transcriptional activators can counteract this type of repressive effect, thanks to their ability to recruit, besides the machinery that is responsible for RNA synthesis, other multi- subunit complexes that constitute the professionals of chromatin remodeling in terms of both structure and content. The two mechanisms of remodeling that have been studied most are the covalent modification of histones and the ATP-dependent nucleosome remodeling. They are both carried out by dedicated enzyme complexes that were first isolated and purified during the last decade. The prototype complex shown to be able to alter nucleosomal structure at the expense of ATP is the so called SWI/SNF complex in yeast. Although we don’t know the exact mechanism, it appears that it involves a sort of “loosening” of the structure of the nucleosome, through the re-distribution of the non covalent contacts between DNA and histones. There are many types of covalent modifications of histones. Acetylation is of particular interest, in part because it is the first type of modification shown to be positively affecting transcription. Ηowever, the question of how acetylation does so has remained open ever since. Alternative and perhaps not necessarily mutually exclusive explanations have been suggested. These can be grouped into two categories. One of these comprises the models that focus on the loss of positive charge as a consequence of the acetylation of positively charged lysines. Relevant studies report changes in the structure of chromatin that are of broad rather than local character. Another view of the positive correlation between histone acetylation and changes in chromatin structure was realized with the discovery of a protein module able to specifically recognize acetylated histone lysine residues. This module was named bromodomain and consists of ~100 aa forming a four-helix bundle. The site of interaction with the modified histone residue lies within a hydrophobic pocket located on one of the two edges of the bromodomain module. Subsequently, protein modules able to recognize other types of histone modifications, such as methylation, were also discovered. This gave birth to a hypothesis according to which post-translational modifications of histones can be “read” in a sequential or combinatorial fashion by proteins armed with the respective motifs. This model offered the molecular basis for explaining how chromatin modifying complexes recruited to promoters are mechanistically linked. The first model gene of a higher organism where the complete biochemical pathway leading to transcriptional activation was followed, (including all necessary chromatin remodeling steps), is the human interferon beta (hIFNβ) gene. This gene is activated by virus infection which leads to the assembly of an enhanceosome at the enhancer region. Enhanceosome is a highly stable yet dynamic nucleoprotein structure encompassing the transcription factors NF-kB, ATF-2/c-Jun, IRF and the architectural transcription factor HMGI(Y). Enhanceosome’s components are held tightly together by means of cooperative interactions between both activators and activators and DNA. The activation surface formed instructs the recruitment of particular chromatin remodeling activities, according to a precisely ordered temporal pattern. The first co- factor to arrive is the histone acetyl-transferase GCN5 which acetylates specific lysine residues of a nucleosome masking the transcription start site and hence obstructing initiation of RNA synthesis. The highly regulated acetylation taking place at the IFNß gene promoter, facilitates the sequential recruitment of SWI/SNF and TFIID complexes, the latter being a component of the basal transcription machinery. Acetylation of specific H3 and H4 histone lysine residues is absolutely required for these two recruitment events, both of which are mediated by bromodomain modules located in subunits of the two complexes. In this study we have explored the importance of both histone acetylation and deacetylation in gene expression. One of the most important questions we addressed was the following: Is acetylation always required for resolving the same inhibitory, local chromatin structure? In other words, is it possible that an alternative biochemical pathway exists, which can overcome the same nucleosome barrier, or should transcriptional activation of the gene always be accompanied by the same set of histone post-translational modifications? Previous studies had shown that chromatin remodeling complexes may not be required in cases where activation strength is increased. This can be achieved by either of two possible ways, namely by increasing the affinity with which the transcriptional activator interacts with its cognate DNA site or by increasing the strength of the activation surface per se, that is by increasing the number of activation domains tethered on the relevant enhancer. The hypothesis had been made that a sufficiently strong enhancer might be able to promote necessary changes in chromatin structure without the need for previous acetylation. In this study, we undertook the experimental investigation of this hypothesis through a detailed analysis and in the context of regulation of a higher organism gene. We replaced the physiological IFNβ enhancer with synthetic enhancers of increasing strength containing multiple copies of the PRDII regulatory element, which is bound by NF-kB. Similarly with the wild type enhancer, the one consisting of a single PRDII site absolutely depends on histone acetylation in order to promote the translocation in cis of the inhibitory nucleosome covering the transcription start site. Histone acetylation is moderately required in the case of an enhancer with two copies of the PRDII element while it becomes completely dispensable when the number of NF-kB sites increases to four. In this latter case the same factors with the wild type gene are recruited although no longer in a temporarilly regulated fashion. We explained this phenomenon on the basis of the formation of an activation surface with unusual affinity, which gives the four NF-kB molecules the chance to interact essentially concomitantly with all components required both for chromatin remodeling (e.g. SWI/SNF) and transcriptional activation (e.g. TFIID). Moreover, histone acetylation does occur (although not required), catalysed by the histone acetyl-transferase CBP. Therefore resolution of the same biochemical problem, that is the remodeling of the inhibitory nucleosome, can be achieved by a different pathway which does not depend on the elements of a “histone acetylation code”, as originally described in the IFNß gene case. Finally, replacement of wild type NF-kB with truncated forms that are impaired in efficiently recruiting either the histone acetyl-transferase CBP or the basal transcription factor TFIID, revealed that in the context of the same inhibitory local chromatin structure, establishing contacts with this critical component of the basal machinery is more important than the ability to acetylate histones.

Η δυνατότητα των κυττάρων να αντιλαμβάνονται τις μεταβολές στο περιβάλλον τους και να προσαρμόζονται σε αυτές, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη βιοσύνθεση των κατάλληλων μακρομορίων. Ένας τέτοιος μηχανισμός με εξαιρετικό, θεωρητικό και πρακτικό, επιστημονικό ενδιαφέρον, είναι η βιοσύνθεση του RNA και ιδιαίτερα εκείνου του τύπου που, μετά τη διαδικασία της μετάφρασης, θα δώσει γένεση στις πρωτεΐνες του κυττάρου. Ακριβώς λόγο της σπουδαιότητας του φαινομένου, τα κύτταρα επενδύουν σε αυτό μεγάλο μέρος των ρυθμιστικών και ελεγκτικών τους μηχανισμών. Εξασκούν, δηλαδή, έλεγχο στο πότε θα εκφραστεί η γενετική πληροφορία, σε τι έκταση θα λάβει χώρα το φαινόμενο, καθώς επίσης και στην πιστότητα με την οποία δραστηριοποιούνται οι σχετικοί ενζυμικοί μηχανισμοί. Προκειμένου να χαρακτηρίσουμε το σύνολο των εμπλεκόμενων βιοχημικών μονοπατιών, λέμε ότι η γονιδιακή έκφραση υπόκειται σε ρύθμιση. Ρόλο-κλειδί στους μηχανισμούς ρύθμισης, παίζουν οι μεταγραφικοί παράγοντες, πρωτεΐνες με εξειδικευμένο μοριακό σχεδίασμά που τους επιτρέπει, αφ' ενός να αλληλεπιδρούν με ειδικό τρόπο με το DNA σε θέσεις που ονομάζονται ρυθμιστικά στοιχεία και αφ' ετέρου να στρατολογούν στο εκμαγείο όλα τα απαραίτητα συστατικά -άλλες πρωτεΐνες- οι οποίες είναι απαραίτητες για τη σύνθεση του σωστού γονιδιακού προϊόντος. Η αναγνώριση συγκεκριμένων αζωτούχων βάσεων του DNA από την υπεύθυνη περιοχή ενός μεταγραφικού παράγοντα, συμβάλλει, κατά ένα μέρος μόνο, στην ειδικότητα που χαρακτηρίζει το όλο φαινόμενο. Η ενεργοποίηση της μεταγραφής ενός γονιδίου, ιδιαίτερα στην περίπτωση κυττάρων ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά υψηλό βαθμό συνεργατικότητας. Αυτό σημαίνει, με απλά λόγια, ότι η έκφραση ενός γονιδίου δεν εξαρτάται από την πρόσδεση ενός μόνο, ή έστω και λίγων μεταγραφικών παραγόντων στη σχετική ρυθμιστική περιοχή. Αντίθετα, ογκώδη πολύ-πρωτεΐνικά σύμπλοκα σχηματίζονται στους υποκινητές των γονιδίων, σα συνέπεια εκτεταμένων διαμοριακών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στους μεταγραφικούς παράγοντες-ενεργοποιητές και διάφορες άλλες πρωτεΐνες, επιφορτισμένες με την εκτέλεση επίσης κρίσιμων βημάτων της διαδικασίας ενεργοποίησης της μεταγραφής. Έτσι, με τον εκτεταμένο επιμερισμό των ρόλων για τη μεταγραφή ενός γονιδίου, περιορίζονται και οι πιθανότητες «ανεπιθύμητης» (μη ελεγχόμενης) έκφρασής του. Επιπλέον, το άθροισμα των ασθενών, πλην όμως πολυάριθμων, συνεργατικών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα συστατικά του ανεγειρόμενου συμπλόκου, εξασφαλίζει και τη σταθερότητά του. Μία από τις ριζικές διαφορές ανάμεσα στα βακτήρια και τα ευκαρυωτικά κύτταρα, είναι η ύπαρξη της χρωματίνης. Είναι η δομή στην οποία προσαρτάται το DNA, προκειμένου να συμπυκνωθεί επαρκώς, μέσα στα όρια που καθορίζονται από τον ευκαρυωτικά πυρήνα. Θεμελιώδης δομική μονάδα της χρωματίνης είναι το νουκλεόσωμα, ένα οκταμερές πρωτεϊνών που ονομάζονται ιστόνες, γύρω από το οποίο περιελίσσονται 147 ζεύγη βάσεων DNA. Ο σχηματισμός νουκλεοσωμάτων και η περαιτέρω οργάνωση της χρωματίνης σε δομές υψηλότερου βαθμού πολυπλοκότητας, έχει μια αναπόφευκτη συνέπεια: τον «εγκλεισμό» κρίσιμων ρυθμιστικών αλληλουχιών του DNA σε περιοχές που παρουσιάζουν τοπική διαμόρφωση αρνητική για τη γονιδιακή έκφραση. Οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές μπορούν να αντιπαρέρχονται τέτοιων ανασταλτικών δομών της χρωματίνης, χάρη στην ικανότητά τους να στρατολογούν, εκτός από τη μοριακή μηχανή σύνθεσης του RNA και πολύ-πρωτεϊνικά σύμπλοκα με δυνατότητες «επέμβασης» στη χρωματίνη και τροποποίησης της διαμόρφωσης και/ή του περιεχομένου της. Δύο από τους καλύτερα μελετημένους μηχανισμούς αναδόμησης της χρωματίνης, είναι η ομοιοπολική, μετά-μεταφραστική τροποποίηση των ιστονών και η αλλαγή της δομής των νουκλεοσωμάτων με κατανάλωση ΑΤΡ. Ενζυμικά σύμπλοκα επιφορτισμένα με τον ένα ή τον άλλο ρόλο, απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν για πρώτη φορά, την προηγούμενη δεκαετία. Το πρωτότυπο σύμπλοκο με δυνατότητα αναδόμησης του νουκλεοσώματος στηριζόμενης στην κατανάλωση ενέργειας, ταυτοποιήθηκε στο σακχαρομήκυτα και ονομάστηκε SWI/SNF. Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστός ο ακριβής μηχανισμός δράσης του. Συνολικά όμως, μπορούμε να πούμε ότι εκείνο που επιτυγχάνεται είναι μια «χαλάρωση» της νουκλεοσωμικής δομής, μέσω ανακατανομής των μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων που καθοδηγούν την περιέλιξη του DNA γύρω από το οκταμερές των ιστονών του νουκλεοσώματος. Περισσότερο μελετημένη ανάμεσα στα διάφορα είδη μετά-μεταφραστικών τροποποιήσεων των ιστονών, είναι η περίπτωση της ακετυλίωσης εξαιτίας, κατά ένα βαθμό τουλάχιστον, της πολύ πρώιμης παρατήρησης (από τη δεκαετία του ’60) ότι συσχετίζεται θετικά με τη μεταγραφή. Παραμένει όμως ανοιχτό μέχρι και σήμερα το ερώτημα για τον τρόπο με τον οποίο η ακετυλίωση επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση. Εναλλακτικές προτάσεις που έχουν διατυπωθεί, μπορούν να διακριθούν σε δύο γενικές κατηγορίες. Η πρώτη περιλαμβάνει τα διάφορα μοντέλα που έχουν ως σημείο αναφοράς τη μεταβολή (απώλεια) φορτίου στα αμινοτελικά άκρα των ιστονών, κατά την προσθήκη ακετυλο-ομάδων. Σχετικές εργασίες αναφέρουν τις συνέπειες που προκύπτουν στην οργάνωση των ινιδίων της χρωματίνης, οι οποίες είναι μάλλον ευρείας κλίμακας, παρά τοπικού χαρακτήρα. Ένας δεύτερος τρόπος με τον οποίο η ακετυλίωση μπορεί να συσχετιστεί με αλλαγές στη δομή της χρωματίνης, προσδιορίστηκε με την ανακάλυψη ενός πρωτεϊνικού μοτίβου το οποίο έχει δυνατότητα να αναγνωρίζει με ειδικό τρόπο κατάλοιπα λυσινών που έχουν ακετυλιωθεί. Το μοτίβο αυτό ονομάστηκε επικράτεια bromo (bromodomain). Τα ~100 αμινοξικά κατάλοιπα που το αποτελούν, διατάσσονται σε μία δέσμη από τέσσερις έλικες, στο ένα άκρο της οποίας σχηματίζεται η υδρόφοβη «θήκη» εισδοχής της ακετυλιωμένης λυσίνης. Η ανακάλυψη και άλλων πρωτεϊνικών μοτίβων που αναγνωρίζουν άλλα είδη τροποποιήσεων των ιστονών, οδήγησε στην ανάπτυξη της υπόθεσης του «κώδικα των ιστονών». Σύμφωνα με αυτόν, πρωτεϊνικά σύμπλοκα εξοπλισμένα με τα κατάλληλα μοτίβα, είναι πιθανό να «διαβάζουν» τις αντίστοιχες τροποποιήσεις με ένα συνεργατικό τρόπο. Η ταυτοποίηση των αλληλεπιδράσεων αυτού του τύπου, ερμήνευσε ικανοποιητικά, σε «μηχανιστικό» επίπεδο, τη διασύνδεση των συμπλοκών που στρατολογούνται σε υποκινητές και εμπλέκονται σε αλλαγές της δομής της χρωματίνης. Το ανθρώπινο γονίδιο της ιντερφερόνης β (IFNβ) ήταν το πρώτο στο οποίο μελετήθηκε συστηματικά το πλήρες βιοχημικό μονοπάτι που περιλαμβάνει τις απαραίτητες αλλαγές στη δομή της χρωματίνης και οδηγεί, τελικά, σε μεταγραφική ενεργοποίηση. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, ο σχηματισμός ενός νουκλεοσώματος στην περιοχή του κεντρικού υποκινητή, αποτρέπει την πρόσδεση του βασικού μεταγραφικού συμπλόκου και τελικά την έναρξη της μεταγραφής, εκτός και αν, κατόπιν επίδρασης του κατάλληλου ερεθίσματος, αναπτυχθεί το αντίστοιχο πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης. Αυτό ξεκινάει με τη συγκρότηση ενός νουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου υψηλού βαθμού οργάνωσης στη ρυθμιστική περιοχή (ενισχυτή) του γονιδίου. Το σύμπλοκο αυτό, που ονομάζεται ενισχυόσωμα, αποτελείται από τους μεταγραφικούς ενεργοποιητές ATF-2/c-Jun, IRF, NF-κΒ και τον «αρχιτεκτονικό» μεταγραφικό παράγοντα HMGI(Y). Συγκροτείται χάρη στην ανάπτυξη πολλαπλών συνεργατικών αλληλεπιδράσεων, που φέρνουν σε επαφή τα συστατικά του ενισχυοσώματος μεταξύ τους, αλλά και με τον υποκείμενο ενισχυτή. Η ενεργοποιητική επιφάνεια του ενισχυοσώματος, διαμεσολαβεί τη στρατολόγηση συγκεκριμένων συμπλοκών τροποποίησης της δομής της χρωματίνης, σύμφωνα με μία απολύτως ιεραρχημένη χρονικά ακολουθία γεγονότων. Πρώτα στρατολογείται η ακετυλο-τρανσφεράση GCN5, η οποία ακετυλιώνει επιλεκτικά ορισμένα κατάλοιπα λυσίνης του ανασταλτικού νουκλεοσώματος. Η διενεργούμενη ακετυλίωση χαρακτηρίζεται από ένα επίσης καλά καθορισμένο χρονικό πρότυπο και συσχετίζεται με την προσέλκυση στον υποκινητή, κατά σειρά, του συμπλόκου SWI/SNF και έπειτα του βασικού μεταγραφικού παράγοντα TFIID. Κανένα από τα δύο γεγονότα στρατολόγησης δεν είναι εφικτό, χωρίς την ειδική αναγνώριση ακετυλο-ομάδων που προστίθενται από την GCN5 σε συγκεκριμένα κατάλοιπα λυσίνης των ιστονών H3 και Η4. Την αναγνώριση αναλαμβάνουν επικράτειες bromo που εμπεριέχονται σε υπομονάδες των δύο συμπλοκών, SWI/SNF και TFIID. Στην εργασία αυτή, επιδιώξαμε να μελετήσουμε περαιτέρω τη σημασία της ακετυλίωσης και απο-ακετυλίωσης στη γονιδιακή έκφραση. Ένα από τα σπουδαιότερα ερωτήματα που θέσαμε ήταν το εξής: η ακετυλίωση είναι πάντα απαραίτητη για την αντιμετώπιση της ίδιας αποτρεπτικής, τοπικής δομής της χρωματίνης; Είναι δυνατό, με άλλα λόγια, να μεταβληθεί η ανασταλτική δομή της χρωματίνης που χαρακτηρίζει τον κεντρικό υποκινητή της IFNβ μέσω ενός άλλου βιοχημικού μονοπατιού, ή θα πρέπει η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου να συνοδεύεται πάντα από το ίδιο πρότυπο μετά-μεταφραστικών τροποποιήσεων; Προηγούμενες μελέτες είχαν δείξει ότι η παρουσία συμπλοκών αναδόμησης της χρωματίνης στους υποκινητές γονιδίων που υπόκεινται σε ρύθμιση, δεν είναι απαραίτητη εφόσον αυξηθεί η ενεργοποιητική ισχύς του αντίστοιχου ενισχυτή. Ένας τρόπος για να συμβεί αυτό, είναι η αύξηση της χημικής συγγένειας με τον οποία οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές αλληλεπιδρούν με τις θέσεις που αναγνωρίζουν επάνω στη χρωματίνη. Ένας δεύτερος τρόπος, είναι η αύξηση της ισχύος αυτής καθ’ αυτής της ενεργοποιητικής επιφάνειας, της αύξησης, επομένως, των περιοχών μεταγραφικής ενεργοποίησης που παρατάσσονται στον υπεύθυνο ενισχυτή. Πιο συγκεκριμένα, είχε διατυπωθεί η πρόβλεψη ότι ένας αρκετά ισχυρός ενισχυτής, είναι πιθανό να προάγει αλλαγές στη δομή της χρωματίνης, χωρίς να είναι απαραίτητη η προηγούμενη ακετυλίωσή της. Η λεπτομερής διερεύνηση αυτής της υπόθεσης, και μάλιστα στα πλαίσια ρύθμισης της έκφρασης ενός γονιδίου ανώτερου ευκαρυωτικού οργανισμού, επιχειρήθηκε για πρώτη φορά μέσα από τα πειράματα της παρούσας εργασίας. Κατασκευάσαμε τεχνητούς ενισχυτές αυξανόμενης ισχύος, μέσω επάλληλης διάταξης αντιγράφων του θετικού ρυθμιστικού στοιχείου PRDII, του στοιχείου που, στον ενισχυτή της ιντερφερόνης β, αναγνωρίζεται από το μεταγραφικό παράγοντα NF-κΒ. Βρήκαμε ότι, όπως και στην περίπτωση του φυσιολογικού γονιδίου, ένας τεχνητός ενισχυτής με μία μόνο θέση πρόσδεσης για τον NF-κΒ, εξαρτάται απόλυτα από την ακετυλίωση των ιστονών, προκειμένου να επιτύχει μετατόπιση in cis του ανασταλτικού νουκλεοσώματος που παρεμποδίζει την έναρξη της μεταγραφής. Ο ενισχυτής με δύο αντίγραφα του στοιχείου PRDII, εξαρτάται μερικώς από την ακετυλίωση, ενώ ένας ισχυρός ενισχυτής με τέσσερις θέσεις πρόσδεσης για τον NF-κΒ, κατευθύνει το πλήρες πρόγραμμα αναδόμησης της χρωματίνης και ενεργοποίησης της μεταγραφής, εντελώς ανεξάρτητα από την ακετυλίωση. Στην τελευταία αυτή περίπτωση, στρατολογούνται οι ίδιοι ακριβώς παράγοντες που ελέγχουν το πρόγραμμα έκφρασης και του φυσιολογικού γονιδίου, αλλά χωρίς να υπάρχει πλέον συγκεκριμένη χρονική σειρά στη σύνδεσή τους με την περιοχή του υποκινητή. Ερμηνεύσαμε το φαινόμενο στη βάση της δημιουργίας μιας εκτεταμένης ενεργοποιητικής επιφάνειας, που επιτρέπει στα τέσσερα μόρια του NF-κΒ να αλληλεπιδρούν ουσιαστικά ταυτόχρονα με όλα τα απαραίτητα συστατικά για την αναδόμηση της χρωματίνης (π.χ. SWI/SNF) και την ενεργοποίηση της μεταγραφής (π.χ. TFIID). Επιπλέον, παρά το γεγονός ότι η ακετυλίωση δεν είναι απαραίτητη για την εκπόνηση του προγράμματος γονιδιακής έκφρασης, πειραματική διερεύνηση που σχεδιάστηκε όπως στην περίπτωση του φυσιολογικού ενισχυτή, έδειξε ότι ο συνθετικός, ισχυρός ενισχυτής PRDIU κατευθύνει την εκτεταμένη ακετυλίωση πολλών, διαφορετικών καταλοίπων λυσίνης, μέσω της ακετυλο-τρανσφεράσης CBP. Επομένως, η επίλυση του ίδιου βιοχημικού προβλήματος, η στόχευση, δηλαδή και αναδόμηση του ίδιου ανασταλτικού νουκλεοσώματος, προωθείται μέσα από ένα διαφορετικό μονοπάτι, στα πλαίσια του οποίου δεν αξιοποιούνται τα στοιχεία του «κώδικα ακετυλίωσης των ιστονών», όπως αυτά προσδιορίστηκαν στο πρωτότυπο γονίδιο της ιντερφερόνης β. Τέλος, η αντικατάσταση του NF-κΒ φυσικού τύπου με ελλείψεις που αδυνατούν να προσελκύσουν αποτελεσματικά την ακετυλο-τρανσφεράση CBP ή το βασικό μεταγραφικό παράγοντα TFIID, αποκάλυψε ότι σε περιβάλλον χρωματίνης με την ίδια τοπική, ανασταλτική δομή, η αποκατάσταση αλληλεπιδράσεων με τον κρίσιμο αυτό παράγοντα του βασικού μεταγραφικού συμπλόκου, έχει ξεκάθαρη προτεραιότητα έναντι της δυνατότητας για ακετυλίωση των ιστονών.