Μελέτη των επιπτώσεων οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών παραγόντων που επηρεάζουν την ποιότητα του συντηρημένου και του κατεψυγμένου σπέρματος σκύλου

Abstract

The objective of this study was to evaluate quality of chilled and frozen-thawed dog semen processed with extenders containing various antioxidants and evaluate the effect of certain oxidant factors on canine spermatozoa. Ejaculates from five dogs were pooled and evaluated for concentration, motility, rapid steady forward (RSF) movement, viability, morphological defects, acrosomal integrity and by the hypo-osmotic swelling (HOS) test. Also, superoxide anion (O2 -.) production, hydroxyl radicals (.OH) and total reactive oxygen species (tROS) were determined. The pool was divided in the appropriate number of aliquots (for control and test conditions), which were diluted with a TRIS-citric acid-glucose-egg yolk extender. The semen aliquots were either chilled and preserved at 4?C (for 24 and 72 hours) or frozen-thawed. The semen extenders were without antioxidants (control) or contained one of the following antioxidant supplements: vitamin C, N-acetyl-Lcysteine (NAC), taurine, catalase, vitamin E or 5-(4-dimethylamino-phenyl)-2-phenyl-penta-2,4- dienoic acid (B16). Calculation of means, standard error and statistical analysis were performed using SPSS 14.0 for Windows software. Data were subjected to one-way analysis of variance (ANOVA) and the Duncan multiple range test was used to define differences among treatments. Levene test was also used to check homogeneity of variances. Differences were considered statistically significant when p<0.05. During the first phase of the present study semen was chilled and preserved at 4?C. Portions of chilled semen were removed at 24 and 72 hours, and semen quality was evaluated after rewarming and oxidants were determined. Each antioxidant (except B16, which was directly used during phase two) was tested in three or four different concentrations in order to choose the concentration that resulted in superior semen quality. This phase was completed in 10 replicates. Even when there was no apparent statistical difference, the selection of the best concentration was based on numerical differences and on longevity of spermatozoa. From this phase the antioxidant concentrations that were chosen were: vitamin C (0.5mM), NAC (0.5mM), taurine (0.2mM), catalase (100u/ml) and vitamin E (0.1mM). These concentrations always referred to sperm concentration of 66.66 x 106spermatozoa/ml. The aim of the second phase was to compare the effect of all the antioxidants, in the previously determined concentrations (plus B16 [5-(4-dimethylamino-phenyl)-2-phenyl-penta- 2,4-dienoic acid] at a concentration of 0.1mM), when semen samples were chilled. This phase was completed in 13 replicates. At 24 hours the mean (±SEM) sperm motility was higher (p<0.001) when vitamin E, taurine and B16 were added in the extender, whereas more spermatozoa with RSF-movement were observed (p<0.001) in the vitamin E, catalase, B16 and taurine groups. Sperm viability was higher (p=0.040) in B16 and vitamin E groups and the percentage of swollen spermatozoa was higher (p=0.002) only in the B16 group. Acrosomal integrity, morphological defects, O2 -. production and .OH were not significantly influenced by any of the antioxidants tested. All antioxidant groups, except vitamin C, contained less tROS compared to the control group, although none of the values differed significantly. At 72 hours sperm motility was higher (p<0.001) when vitamin E, catalase, B16, taurine and NAC were added in the extender. More spermatozoa with RSF-movement were observed (p<0.001) in the vitamin E, catalase, B16, taurine and NAC treatment groups. Sperm viability was higher (p=0.001) when vitamin E, B16, taurine and vitamin C were added in semen extenders. HOS-test percentages were higher (p=0.016) in the B16, vitamin E, catalase and NAC groups. The taurine group showed higher percentages (p=0.025) of morphologically normal spermatozoa, compared with the control group. Whereas, the taurine and vitamin E groups had lower percentages of spermatozoa with secondary defects (p=0.029). Acrosomal integrity was not influenced in any case. Superoxide anion production was significantly higher in catalase group compared with all the other groups (p=0.019). Hydroxyl radicals were not significantly influenced by any of the antioxidants tested. The addition of vitamin E, catalase and B16 in semen extenders resulted in significantly lower tROS values compared with the controls (p<0.001). The aim of the third phase was to compare the effect of all the antioxidants, in the previously determined concentrations, when semen samples were frozen-thawed. This phase was completed in 10 replicates. Post-thaw semen evaluation showed that mean (±SEM) motility was increased (p<0.001) after addition of catalase, whereas more spermatozoa with RSF-movement were observed (p<0.001) after the catalase, NAC and vitamin E treatments, compared with the control group...

Σκοπός της διατριβής ήταν η µελέτη των επιπτώσεων ορισµένων οξειδωτικών παραγόντων, καθώς και της επίδρασης διαφόρων αντιοξειδωτικών ουσιών στα αραιωτικά του συντηρηµένου και του κατεψυγµένου-απόψυγµένου σπέρµατος, στα σπερµατοζωάρια του σκύλου. Για την έρευνα χρησιµοποιήθηκαν πέντε σκύλοι, των οποίων τα εκσπερµατίσµατα συλλέγονταν, αναµιγνύονταν και στη συνέχεια ακολουθούσε η εκτίµηση των παραµέτρων της κινητικότητας, της ζωτικότητας, των µορφολογικών ανωµαλιών, της ακεραιότητας του ακροσώµατος και της αντοχής στην υποωσµωτική δοκιµή. Επιπλέον, γινόταν προσδιορισµός της συγκέντρωσης του υπεροξειδικού ανιόντος, των ριζών υδροξυλίου και των ολικών δραστικών µορφών οξυγόνου. Στη συνέχεια, το διαθέσιµο υλικό χωριζόταν στον απαραίτητο αριθµό δειγµάτων που υποβάλλονταν είτε σε διαδικασία συντήρησης-αναθέρµανσης είτε σε διαδικασία κατάψυξης-απόψυξης, µε χρήση ενός αραιωτικού που είχε ως βάση Tris, κιτρικό οξύ, γλυκόζη και κρόκο αυγού. Τα αραιωτικά συντήρησης και κατάψυξης δεν περιείχαν (µάρτυρας) ή περιείχαν ένα από τα υπό εξέταση αντιοξειδωτικά (βιταµίνη C, ακετυλοκυστεΐνη, ταυρίνη, καταλάση, βιταµίνη Ε ή Β16). Τα αποτελέσµατα του πειραµατισµού για κάθε µεταβλητή υποβλήθηκαν σε ανάλυση διακύµανσης (ANOVA), εντός του µεθοδολογικού πλαισίου των γενικών γραµµικών προτύπων, ακολουθούµενη από τον έλεγχο Duncan. Ως επίπεδο σηµαντικότητας των ελέγχων ορίστηκε από την αρχή το 0,05 (P=0,05). Για τον έλεγχο της οµοιογένειας των δειγµάτων χρησιµοποιήθηκε η δοκιµή του Levene. Στο πρώτο στάδιο πειραµατισµών δοκιµάστηκε η αποτελεσµατικότητα τριών ή τεσσάρων προεπιλεγµένων συγκεντρώσεων κάθε µίας από τις αντιοξειδωτικές ουσίες (εκτός του Β16, που χρησιµοποιήθηκε απευθείας στο δεύτερο στάδιο), σε συνθήκες συντήρησης του σπέρµατος. Τα δείγµατα σπέρµατος ελέγχονταν στις 24 και στις 72 ώρες ως προς την παρουσία δραστικών µορφών οξυγόνου και ως προς τα ποιοτικά χαρακτηριστικά τους µε στόχο την επιλογή της πλέον αποτελεσµατικής για την ποιότητα του σπέρµατος συγκέντρωσης του κάθε αντιοξειδωτικού. Η επιλογή της συγκέντρωσης της κάθε αντιοξειδωτικής ουσίας βασίστηκε στα αποτελέσµατα δέκα επαναλήψεων. Στη φάση αυτή δεν διαπιστώθηκαν σηµαντικές µεταβολές για την πλειοψηφία των συγκεντρώσεων του κάθε αντιοξειδωτικού και η επιλογή βασίστηκε στην αριθµητική υπεροχή και στην απόδοση του ποιοτικά καλύτερου σπέρµατος, σε βάθος χρόνου. Από την ολοκλήρωση αυτής της φάσης προέκυψαν οι εξής συγκεντρώσεις αντιοξειδωτικών: βιταµίνη C 0,5mM, ακετυλοκυστεΐνη 0,5mM, ταυρίνη 0,2mM, καταλάση 100u/ml και βιταµίνη Ε 0,1mM. Οι συγκεντρώσεις αυτές αντιστοιχούσαν πάντοτε σε δείγµατα σπέρµατος µε πυκνότητα 66,66 x 106 σπερµατοζωαρίων/ml. Στο δεύτερο στάδιο πειραµατισµών πραγµατοποιήθηκαν συγκρίσεις της επίδρασης των αντιοξειδωτικών ουσιών στην προεπιλεγµένη συγκέντρωση (όπως αυτή είχε προσδιοριστεί κατά το πρώτο στάδιο), στη συντήρηση του σπέρµατος. Στο στάδιο αυτό ελέγχθηκε επιπλέον και η επίδραση του αντιοξειδωτικού Β16 [5-(4-διµεθυλαµινο-φαινυλ-)-2-φαινυλο-πεντανο-2,4- διενοϊκό οξύ], σε συγκέντρωση 0,1mM. Τα συµπεράσµατα σχετικά µε την επίδραση της κάθε αντιοξειδωτικής ουσίας βασίστηκαν στα αποτελέσµατα 13 επαναλήψεων. Μετά από 24 ώρες συντήρησης η κινητικότητα ήταν σηµαντικά υψηλότερη (P<0,001) στα δείγµατα σπέρµατος που περιείχαν βιταµίνη Ε, ταυρίνη και Β16, ενώ περισσότερα σπερµατοζωάρια εµφάνιζαν έντονη σταθερή προς τα εµπρός (ΕΣΕ) κίνηση (P<0,001) στις οµάδες της βιταµίνης Ε, της καταλάσης, του Β16 και της ταυρίνης, συγκριτικά µε την οµάδα του µάρτυρα. Η ζωτικότητα ήταν υψηλότερη (P=0,040) στα δείγµατα σπέρµατος που είχε προστεθεί Β16 και βιταµίνη Ε και το ποσοστό των διογκωµένων, κατά την υποωσµωτική δοκιµή, σπερµατοζωαρίων ήταν µεγαλύτερο (P=0,002) µόνο στην οµάδα του Β16, σε σύγκριση µε την οµάδα του µάρτυρα. Η ακεραιότητα του ακροσώµατος, οι µορφολογικές ανωµαλίες , ο ρυθµός παραγωγής του υπεροξειδικού ανιόντος και οι τιµές των ριζών υδροξυλίου δεν επηρεάστηκαν σηµαντικά σε καµία από τις µεταχειρίσεις, σε σχέση µε το µάρτυρα. Σε αυτό το χρόνο εξέτασης οι ολικές δραστικές µορφές οξυγόνου µειώθηκαν σε όλες τις οµάδες των αντιοξειδωτικών, εκτός της βιταµίνης C, αλλά η µείωση αυτή δεν ήταν στατιστικά σηµαντική. Μετά από 72 ώρες συντήρησης η κινητικότητα ήταν σηµαντικά αυξηµένη (P<0,001) στα δείγµατα σπέρµατος που περιείχαν βιταµίνη Ε, καταλάση, Β16, ταυρίνη και ακετυλοκυστεΐνη, σε σύγκριση µε το µάρτυρα. Τα ποσοστά των σπερµατοζωαρίων που επιδείκνυαν ΕΣΕ κίνηση ήταν σηµαντικά αυξηµένα (P<0,001) στις οµάδες της βιταµίνης Ε, της καταλάσης, του Β16, της ταυρίνης και της ακετυλοκυστεΐνης...