Ποιοτική σύσταση, βιοδραστικά συστατικά και αντιοξειδωτικές ιδιότητες εκχυλισμάταων των υπέργειων τμημάτων του φυτού βαλσαμόχορτο (Hypericum perforatum L.)

Abstract

St John’s wort {Hypericum perforatum L.) has been known since antiquity for many medicinal properties such as hepatic disorders and gastric ulcers. In the last two decades, anti-inflammatory, anti-microbial, anti-viral, anti-depressant and cytotoxic activities have also been attributed to the total extract or individual components. Its major active constituents are hypericin, pseudohypericin and hyperforin. In the present study, the qualitative and quantitative composition of the Hypericum perforatum L. collected from Ioannina, Epirus region, has been investigated. After the collection, the plant was divided into five parts (stems, non flower-bearing stems with leaves, flower-bearing stems with leaves, buds and flowers). Each part was extracted with organic solvents and water. For the determination of the major active components of all plant extracts, an improved RP-HPLC gradient elution method was employed. Another improved RP-HPLC isocratic elution method was used for the quantification of hypericins and hyperforin. Total phenols and chlorophylls were also determined in each extract. Moreover, the antioxidant activity of all hypericum extracts was evaluated by seven different methods: (1) free-radical scavenging activity, (2) superoxide anion scavenging activity, (3) metal chelating activity, (4) reducing power, (5) lipid phase antioxidant activity: TBARS method, (6) prevention of oxidative damage to proteins, (7) linoleic acid antioxidant activity determination. In addition, an on-line HPLC method was used for a fast screening of antioxidant-radical scavenging activity of the extracts. The HPLC-separated analytes reacted postcolumn with a methanolic solution of DPPH* and hence reactive compounds can be distinguished. Furthermore, an on-fibre derivatisation headspace solid-phase microextraction (HS- SPME) was successfully applied as a screening method for the measurement of in vitro antioxidant activity through monitoring MDA, pentanal and hexanal, final products of lipid peroxidation in lipid matrices. The method has been sufficiently optimized and can also be applied as an analytical tool taking advantage of the unsurpassed sensitivity of ECD. Finally, the analysis of hypericins and hyperforin in biological fluids is reported using single-drop liquid-phase microextraction (SDME) in conjunction with HPLC-UV- fluorescence detection. The method suites the requirements of clinical studies involving hypericum extract allowing for a rapid, inexpensive and reproducible determination of low concentrations of hypericin, pseudohypericin and hyperforin in human plasma and urine.

Το φυτό του Αγίου Ιωάννη {Hypericum perforatum L.) είναι γνωστό από την αρχαιότητα για τις θεραπευτικές του ιδιότητες σε περιπτώσεις ηπατικής δυσλειτουργίας και γαστρικού έλκους. Τις δύο τελευταίες δεκαετίες, έχουν αναφερθεί αντιφλεγμονώδεις, αντιμικροβιακές, αντιϊκές, αντικαταθλιπτικές και κυτταροτοξικές ιδιότητες του συνολικού εκχυλίσματος ή κάποιων συστατικών του. Τα κυριότερα συστατικά του είναι η υπερεικίνη, η ψευδοϋπερεικίνη και η υπερφορίνη. Στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκε η ποιοτική και ποσοτική σύσταση του φυτού Hypericum perforatum L. από την περιοχή της Ηπείρου. Μετά τη συλλογή, ακολούθησε διαχωρισμός του υπέργειου τμήματος του φυτού σε πέντε μέρη: βλαστούς, μη ανθοφόρους βλαστούς με φύλλα, ανθοφόρους βλαστούς με φύλλα, ανθοφόρους οφθαλμούς και άνθη. Καθένα από τα μέρη αυτά εκχυλίστηκε με οργανικούς διαλύτες και με ύδωρ. Για τον προσδιορισμό των κυριότερων συστατικών όλων των φυτικών εκχυλισμάτων χρησιμοποιήθηκε μια βελτιστοποιημένη RP-HPLC μέθοδος βαθμωτής έκλουσης. Μια δεύτερη βελτιστοποιημένη RP-HPLC μέθοδος ισοκρατικής έκλουσης χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των υπερεικινών και της υπερφορίνης. Σε κάθε εκχύλισμα προσδιορίστηκε επίσης η ποσότητα των συνολικών φαινολικών ενώσεων και χλωροφυλλών. Ακόμη, εκτιμήθηκε η αντιοξειδωτική δράση όλων των εκχυλισμάτων υπέρεικου με χρησιμοποίηση επτά διαφορετικών μεθόδων: (1) ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, (2) ικανότητα δέσμευσης του σουπεροξειδικού ανιόντος, (3) ικανότητα σχηματισμού χηλικών συμπλοκών, (4) αναγωγική ισχύς, (5) αναστολή της λιπιδικής οξείδωσης - μέθοδος θειοβαρβιτουρικού οξέος, (6) αναστολή της οξείδωσης των πρωτεϊνών, (7) μέτρηση αναστολής οξείδωσης του λινελαϊκού οξέος. Επιπλέον, με χρησιμοποίηση ενός on-line συστήματος μέτρησης της DPPH* αντιοξειδωτικής δράσης εντοπίστηκαν τα συστατικά του υπέρεικου με τη μεγίστη αντιοξειδωτική δράση. Επίσης, αναπτύχθηκε μια βελτιστοποιημένη, απλή και εύκολα εφαρμόσιμη μέθοδος μικροεκχύλισης στερεάς φάσης (HS-SPME) προκειμένου να εκτιμηθεί η αναστολή της οξείδωσης γαλακτώματος ηλιελαίου από φυτικά εκχυλίσματα υπέρεικου, με παρακολούθηση των παραγόμενων αλδεϋδικών ενώσεων (παράγωγα MDA, πεντανάλης, εξανάλης). Η βελτιστοποιημένη αυτή μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί για αναλυτικούς σκοπούς και σε άλλα φυτικά εκχυλίσματα, εκμεταλλευόμενη την υψηλή ευαισθησία του ανιχνευτή ECD και το χαμηλό συγκριτικά κόστος της οργανολογίας. Τέλος, αναπτύχθηκε μια απλή, γρήγορη και αναπαραγώγιμη μικροαναλυτική εκχυλιστική μέθοδος για τον προσδιορισμό υπερεικίνης, ψευδοϋπερεικίνης και υπερφορίνης σε βιολογικά δείγματα (ούρα και πλάσμα αίματος), μετά από κατανάλωση αιθανολικού εκχυλίσματος υπέρεικου.