Μελέτη υπερπολυμορφικών περιοχών του μιτοχονδριακού DNA με ανάλυση πρωτοδιάταξης στον ελληνικό πληθυσμό και αξιοποίησή της σε ιατροδικαστικές μελέτες

Abstract

In order to identify polymorphic positions, to determine their frequency in HVI segment of mt-DNA and create a data base of Greek population, the HVI segment of 100 unrelated individuals from Greece were amplified and directly sequenced. Sequence comparison led to the identification of 86 mitochondrial lineages. The most frequently occurring lineage comprised 8 individuals, the second one 5, the third one 4 whereas near all the others types of HVI segment sequences were observed in only one individual. Sequence variation is mostly caused by nucleotide substitutions. As compared to nucleotide substitutions, the frequency of transitions were predominate to tranversions with proportion 75:30. Concerning the type of transitions, pyrimidine s were predominate to purines. Specifically, the rate was 58:17. Sequence variation caused by insertions or deletions was registered only two times, two insertions were noticed in two different samples and one deletion in one sample. As a result of sequencing, the HVI segment of the mitochondrial control region from 100 Greek Caucasians presented a genetic diversity estimated at 0.994. The probability of two randomly selected individuals from a population having identical mt-DNA types is 1.55%. Pairwise nucleotide differences distribution for the HVI segment, Greeks present a peak at 3 differences with a mean pairwise difference 4.67. In this study, a sequence analysis of the HVI hypervariable segment of the control region in the Greek population, was performed. This analysis allows us to find the distribution of deviations, with respect to the Anderson sequence and the distribution of pairwise nuckleotide differences between the analysed individuals. Mitochondrial DNA typing has proven to be valuable as a means for human identification in many forensic cases in order to investigate court of law cases. Once an mt-DNA type has been established, a determination of the frequency of this type in the general population could be presented. As with all forensic identification techniques, mt-DNA sequencing could be more informative and credible in forensic identity cases when additional population studies are underway to further increase the forensic mt-DNA database.

Με σκοπό τη μελέτη του πολυμορφισμού στην υπερπολυμορφική περιοχή HVI του mt-DNA και τον καθορισμό της συχνότητας με την οποία εμφανίζονται οι διάφοροι mt-DNA τύποι στην περιοχή αυτή με στόχο τη σύσταση μιας γενετικής βάσης δεδομένων στον Ελληνικό πληθυσμό, πραγματοποιήθηκε η επιλεκτική ποσοτική ενίσχυση και η άμεση ανάλυση πρωτοδιάταξης της HVI περιοχής του mt-DNA 100 ατόμων Ελληνικής καταγωγής, άνδρες και γυναίκες που δεν είχαν μεταξύ τους συγγένεια εξ αίματος. Στο σύνολο των δειγμάτων που αναλύθηκαν, και σε σύγκριση με την ακολουθία αναφοράς βάσεων κατά Anderson, εντοπίσθηκαν 86 μιτοχονδριακοί τύποι. Ο πιο συχνά εμφανιζόμενος μιτοχονδριακός τύπος είναι αυτός που εμφανίζεται σε οκτώ (8) διαφορετικά άτομα, ένας ακόμη που είναι κοινός σε πέντε (5) διαφορετικά άτομα, ένας άλλος κοινός σε τέσσερα (4) διαφορετικά άτομα, ενώ όλοι σχεδόν οι υπόλοιποι, παρατηρήθηκαν σε ένα μόνο άτομο ο καθένας. Οι περισσότερες παρεκκλίσεις αφορούσαν αντικαταστάσεις βάσεων η πλειονότητα των οποίων ήταν μεταβάσεις και οι υπόλοιπες μεταστροφές. Συγκεκριμένα, η αναλογία του αριθμού των μεταβάσεων προς τον αριθμό των μεταστροφών είναι 75:30. Όσον αφορά το είδος των μεταβάσεων διαπιστώνεται ότι η αναλογία των μεταβάσεων των πυριμιδινών υπερισχύουν των μεταβάσεων των πουρινών, και μάλιστα σε αναλογία 58:17. Στα δείγματα που μελετήθηκαν, πολυμορφισμοί μήκους (προσθήκες — απαλοιφές), σε σχέση με την ακολουθία αναφοράς του Anderson, παρατηρήθηκαν σε περιορισμένο αριθμό θέσεων στην HVI περιοχή. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκαν και καταγράφηκαν μόνο δύο προσθήκες βάσεων, σε δύο διαφορετικά δείγματα και μία απαλοιφή βάσης σε ένα μόνο δείγμα. Η στατιστική επεξεργασία των ληφθέντων αποτελεσμάτων της εργασίας αυτής, ανέδειξε: α) βαθμό γενετικής ποικιλότητας της τάξεως του 99,4% και β) πιθανότητα δύο τυχαία επιλεγμένων μη συγγενή ατόμων να έχουν απαράλλακτους mt-DNA τύπους, της τάξεως του 1.55%. Η σύγκριση ανά ζεύγος μεταξύ τους και των 100 ατόμων, με σκοπό τη μελέτη της κατανομής του παρατηρούμενου αριθμού των νουκλεοτιδικών διαφορών, έδειξε ότι το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων εμφάνιζαν 3 διαφορές, με μέσο όρο διαφορών ανά ζεύγος ατόμων 4,67. Στο θεωρητικό επίπεδο, η εργασία αυτή προσανατολίστηκε στην ανεύρεση της κατανομής του αριθμού των παρεκκλίσεων από την ακολουθία αναφοράς του Anderson, της κατανομής των θέσεων πολυμορφισμού όλων των δειγμάτων και στον προσδιορισμό της μέσης τιμής νουκλεοτιδικών διαφορών που προκύπτει από τη σύγκριση των δειγμάτων του ατόμων 4,67. Στο θεωρητικό επίπεδο, η εργασία αυτή προσανατολίστηκε στην ανεύρεση της κατανομής του αριθμού των παρεκκλίσεων από την ακολουθία αναφοράς του Anderson, της κατανομής των θέσεων πολυμορφισμού όλων των δειγμάτων και στον προσδιορισμό της μέσης τιμής νουκλεοτιδικών διαφορών που προκύπτει από τη σύγκριση των δειγμάτων του πληθυσμού ανά ζεύγη. Κύριος πρακτικός προσανατολισμός της εργασίας αυτής ήταν η εφαρμογή της ανάλυσης πρωτοδιάταξης της HVI περιοχής του mt-DNA στη διερεύνηση υποθέσεων δικαστικού ενδιαφέροντος και σύμφωνα με την θεωρητική και πρακτική προσέγγιση της μελέτης αυτής , καθίσταται φανερή η ανάγκη επέκτασής της σε ένα μεγαλύτερο εύρος του Ελληνικού πληθυσμού, δεδομένου ότι όπως κάθε άλλη μέθοδος γενετικής ταυτοποίησης, έτσι και αυτή της ανάλυσης πρωτοδιάταξης του mt-DNA, γίνεται περισσότερο πληροφοριακή και αξιόπιστη όταν η βάση δεδομένων που χρησιμοποιείται αφορά σε πληθυσμό μεγάλου αριθμού ατόμων.