Έκφραση του αναστολέα p27 στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Συσχέτιση με τους ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου p53 και pRb και τις κινητικές παραμέτρους

Abstract

Aim: Downregulation or overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 have been observed in a range of malignancies, including lung cancer. In order to further elucidate the role of the molecule in tumor growth regulation, we evaluated p27 expression in a series of non-small cell lung carcinomas (NSCLCs), and examined its relation with histology, kinetic parameters, ploidy and overall survival. We extended our investigation into the association of p27 levels with the presence of Ki-ras mutations, as well as with the expression status of p53 and pRb in tumor cells. Material and Methods: p27, p53 and pRb status were immunohistochemically evaluated in a total of 69 NSCLCs. In situ assays were employed to assess the kinetic parameters (Ki-67 immunohistochemistry for proliferation index, Tdt-mediated dUTP Nick End Labelling assay for apoptotic index). The ploidy status of the tumors was assessed after staining nuclei with the Feulgen procedure whereas the presence of Ki-ras mutations was examined by Restriction Fragment Length Polymorphisms. All possible associations were assessed with a series of statistical methods. Results: Immunoreactivity for p27 was observed in the entire series of specimens, with the mean percentage of positive cells being 33%. Adenocarcinomas (AdCs) exhibited higher p27 levels compared to squamous cell carcinomas (SqCCs) (p<0.01). An inverse correlation was established between p27 expression and proliferation index (PI) (r = -0.834, p<0.01) but not with apoptotic index (AI), whereas aneuploid tumors were characterized by lower p27 levels than diploid ones (p<0.01). No difference in p27 immunostaining was observed with regard to the presence of Ki-ras mutations, while aberrant p53 and/or pRb expression patterns were associated with p27 under expression (p<0.01 for p53 status, p<0.05 regarding pRb levels, and p<0.01 for a combined deregulation of both proteins). Two or more alterations in the p27/p53/pRb protein network (i.e. p27 levels lower than the estimated mean value, overexpressed p53 and/or aberrant pRb) were associated with increased PI and aneuploidy (p<0.001 and p<0.01, respectively). A powerful trend was found between p27 expression and overall survival (p = 0.066). Conclusions: Our findings confirm the heterogeneity between AdCs and SqCCs, and are suggestive of an increased proliferative activity in NSCLCs under expressing p27. Furthermore, our analysis supports the concept of p27 forming a functionally compact network with p53 and pRb, which is actively involved in the regulation of cellular proliferation and chromosomal stability.

Σκοπός: Υπερέκφραση ή χαμηλή έκφραση του αναστολέα των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών p27 έχει παρατηρηθεί σε ένα πλήθος κακοηθών νεοπλασμάτων, συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου του πνεύμονα. Για την περαιτέρω διευκρίνιση του ρόλου του μορίου στην ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου, μελετήθηκε η p27 έκφραση σε μία σειρά μη-μικροκυτταρικών καρκινωμάτων του πνεύμονα και διερευνήθηκε η σχέση αυτής με τον ιστολογικό τύπο, τις κινητικές παραμέτρους, την κατάσταση πλοειδίας και την συνολική επιβίωση των αντίστοιχων ασθενών. Η μελέτη επεκτάθηκε και στην διερεύνηση της σχέσης των p27 πρωτεϊνικών επιπέδων με την παρουσία μεταλλάξεων στο Ki-ras γονίδιο καθώς και την πρωτεϊνική έκφραση των p53 και pRb στα καρκινικά κύτταρα. Υλικό και μέθοδοι: Η πρωτεϊνική έκφραση των p27, p53 και pRb μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά σε ένα σύνολο 69 μη-μικροκυτταρικών καρκινωμάτων του πνεύμονα. Χρησιμοποιήθηκαν in situ τεχνικές για την εκτίμηση των κινητικών παραμέτρων (ο δείκτης πολλαπλασιασμού εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημική εντόπιση του Ki-67 αντιγόνου και ο δείκτης απόπτωσης με την τεχνική σήμανσης ελεύθερων 3' άκρων του DNA με χρήση του ενζύμου τελική τρανσφεράση). Η κατάσταση πλοειδίας των όγκων μελετήθηκε με χρώση των πυρήνων με την τεχνική Feulgen και η παρουσία Ki-ras μεταλλάξεων με την τεχνική πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων με περιοριστικές ενδονουκλεάσες (RFLP). Οι πιθανές σχέσεις μελετήθηκαν με μια σειρά στατιστικών δοκιμασιών. Αποτελέσματα: Ανοσοεντόπιση της p27 παρατηρήθηκε σε όλα τα δείγματα με 33% μέσο ποσοστό θετικών καρκινικών κυττάρων. Τα αδενοκαρκινώματα παρουσίαζαν υψηλότερα p27 πρωτεϊνικά επίπεδα σε σύγκριση με τα πλακώδη καρκινώματα (p<0.01). Παρατηρήθηκε μία ανάστροφη συσχέτιση μεταξύ της p27 έκφρασης και του δείκτη πολλαπλασιασμού (r = -0.834, p<0.01), όχι όμως και μεταξύ αυτής και του δείκτη απόπτωσης. Οι ανευπλοειδικοί όγκοι χαρακτηρίζονταν από χαμηλότερα p27 επίπεδα από τους διπλοειδικούς (p<0.01). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά της p27 ανοσοχρώσης ως προς την παρουσία Ki-ras μεταλλάξεων, ενώ μη φυσιολογική έκφραση της πρωτεΐνης p53 και/ή της πρωτεΐνης pRb σχετίζονταν με p27 υποέκφραση (p<0.01 για την p53 έκφραση, p<0.05 για τα pRb επίπεδα, και p<0.01 για την συνδυασμένη απορρύθμιση και των δύο πρωτεϊνών). Δύο ή περισσότερες αλλοιώσεις του p27/p53/pRb πρωτεϊνικού δικτύου (δηλ. p27 επίπεδα χαμηλότερα της μέσης τιμής που υπολογίσθηκε, μεταλλαγμένη p53 και ανώμαλη έκφραση του pRb) σχετίζονταν με αυξημένο πολλαπλασιασμό και ανευπλοειδία (p<0.001 και p<0.01 αντίστοιχα). Ισχυρή τάση για θετική συσχέτιση διαπιστώθηκε μεταξύ της ολικής επιβίωσης των ασθενών και της p27 έκφρασης (p = 0.066). Συμπεράσματα: Τα ευρήματα της εργασίας αυτής επιβεβαιώνουν την ετερογένεια μεταξύ αδενοκαρκινωμάτων και πλακωδών καρκινωμάτων του πνεύμονα και υποδηλώνουν αύξηση της δυνατότητας πολλαπλασιασμού στα μη μικροκυτταρικά καρκινώματα του πνεύμονα που εμφανίζουν χαμηλή p27 έκφραση. Επιπλέον, η συγκεκριμένη μελέτη υποστηρίζει την άποψη ότι η πρωτεΐνη p27 σχηματίζει ένα λειτουργικό δίκτυο με τις πρωτεΐνες p53 και pRb, το οποίο ενέχεται ενεργά στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της χρωμοσωμικής σταθερότητας.