Μελέτη της προσκόλλησης, της ανάπτυξης και του φαινοτύπου λευχαιμικών βλαστικών κυττάρων επί επιφανειών επικαλυμμένων με φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη. Δοκιμασίες on vitro σε κυτταρικές καλλιέργειες

Abstract

The great heterogeneity of leukemias also concerns the relation between leukemic cells and bone marrow microenvironment. This relation is extremely interesting. The aim of the present study is to clarify the adhesive properties of leukemic cells on surfaces coated with fibronectin and laminin, as well as their behavior during time. The material of the study consists of cells from 4 established cell lines (aged 5-11 yrs.) and blasts from the peripheral blood of patients with acute, de novo, leukemias. Cell Lines: • KG-91: cells negative for α4β1 and α5β1 integrins and negative or slightly positive for α5β1 integrin. These cells express Glyc A and γ-globin chain, in small proportion. • KA-93: cells negative for α4β1, α5β1 and α6β1 integrins and slightly positive for Glyc A and γ-globin chain. • ZA-93: cells strongly positive for α4β1 integrin and negative for α5β1 and α6β1. They also express B-lymphocyte markers (IgMk). • MK-97: cells positive for α4β1 integrin, negative for α5β1 and α6β1 molecules, with expression of B-lymphocyte markers (IgAk). Blast Cells from acute, de novo, leukemias: 8 AMLs (1 MO, 3 Ml, 2 M2, 1 M3, 1 M4) and 3 ALLs (2 B, 1 T). These blast cells express type specific markers in certain degree. They are also positive, independently of their maturation stage, for α4β1 and α5β1 integrins and negative for α6β1. The method of the study is based on the suspension of cells with high viability, in liquid culture medium (RPMI 1640 - Glutamax I) and their placement on surfaces coated with fibronectin or laminin. Simultaneously, “control cells” were placed on surfaces coated with Bovine Serum Albumin (BSA - “control cells”). Initial cell concentration was 120-500x105 cells/cm2. Initially the adhesive capability (% of adherent cells) over 1 hour, was estimated using the “adherence test”. Cell cultures were maintained on protein surfaces (Fn, Lm, BSA) for an additional 1-3 or occasionally more days, in order to investigate the proliferation, phenotype and adhesive capability of the cells. The results of the study are the following: I. FN-coated surfaces. a) Cell lines: KG-91 and KA-93 cells, did not show any adhesive capability according to the “adherence test” results. After remaining for 24 hours on Fn-coated surfaces, expression or augmentation of α5β1 integrin was noted, combined with increased expression of Glyc A and γ-globin chain. The above findings were not accompanied by adherence of the examinated cells on Fn. The difference in the behaviour of the two cell lines during their placement on Fn, is the statistically important decrease in KG-91 cells proliferation during the first 24 hours. According to the RT-PCR results, both cell lines, on Fn, exhibited increased expression of ε and γ genes of globin chains. The cells of ZA-93 and MK-97 lines, which share the same B-lymphocyte phenotype, even though their leukemic origin differs, did not exhibit any adhesive properties. No difference was noted during the placement of ZA-93 cells on Fn surfaces for 3 days. On the other hand, MK-97 cells lost α4β1 integrin and expressed α5β1 with simultaneous adhesive capability. The above differences among cell lines, especially those with the same phenotype, reveal and suggest the different nature of cells. b) Blast cells from acute de novo leukemias: Blast cells from acute leukemias express, in various degree, α4β1 and α5β1 integrins. This expression is not related to the differentiation stage or the adhesive capability. Among the 8 AMLs studied, 4 exhibited certain degree of adherence (ranging from 9-75%), while from the 3 ALLs studied adherence was noted in 2 cases (adhesive percentage 53% and 30% respectively). During their culture on protein surfaces for 3-5 day, blast cells from AMLs retained high viability and showed increased expression of α4β1 molecule with simultaneous adhesion (on Fn). This observation was irrelevant to the results from “adherence test”. In 2 cases, an increase in expression of myeloid markers was noted, suggesting a certain degree of differentiation. II. Laminin protein surfaces. Not only the cells from leukemic lines, but also the blast cells from acute leukemias, did not express α6β1 integrin, which is the principle adhesive molecule for laminin. The “adherence test” for all 4 cell lines studied and blast cells from AML (M3v) was negative. During the placement of the above cells on laminin layer for 3 days, no expression of α6β1 integrin or any difference in the proliferation rate or phenotype of the cells, was noted. Given the results described above, the following conclusions can be drawn: • From the data concerning the cell lines with erythroid characteristics, the specific, already known, relation between Fn and erythroid differentiation is obvious. This differentiation was demonstrated in the present study by the increase in Glyc A expression, as well as the augmentation of hemoglobin chain synthesis (considerable information, demonstrated for the first time). • There is no doubt concerning the flexibility of α4β1 and α5β1 integrins and the effect of Fn on α5β1 expression. • The expression and function of adhesive molecules on blast cell surfaces, varies and does not correlate with the type of leukemia. This is probably due to the heterogeneity of leukemias. In contrast to Fn, laminin does not seem to increase the expression of its specific adhesive molecule α6β1, although the variety of laminin isotypes does not allow the extraction of safe conclusions.

Η μεγάλη ετερογένεια των λευχαιμιών αφορά και στη σχέση των λευχαιμικών κυττάρων με το μικροπεριβάλλον του μυελού, σχέση ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα. Η παρούσα εργασία αναφέρεται στον έλεγχο προσκολλητικότητας λευχαιμικών κυττάρων επί επιφανειών «καθηλωμένης» φιμπρονεκτίνης και λαμινίνης και τη συμπεριφορά τους κατά την παραμονή τους επί των επιφανειών αυτών πέραν του 24ώρου. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα 4 λευχαιμικών σειρών (ηλικίας 5-11 ετών) και βλάστες από το αίμα ασθενών με οξεία, πρωτοδιαγνωσθείσα (de novo), λευχαιμία. Κυτταρικές σειρές: • ΚΓ-91: κύτταρα αρνητικά για ιντεγκρίνες α4β1 και α6β1 και αρνητικά ή με ασθενή έκφραση α5β1. Σε μικρό κυμαινόμενο ποσοστό εκφράζουν γλυκοφορίνη A και γ- σφαιρινική άλυσο. • ΚΑ-93: κύτταρα αρνητικά για τα μόρια α4β1, α5β1 και α6β1, με ασθενή έκφραση ερυθροειδών δεικτών γλυκοφορίνης A και γ-αλύσου. • ΖΑ-93: κύτταρα με έντονη έκφραση α4β1 και αρνητικά για α5β1 και α6β1. Παρουσιάζουν δείκτες Β-λεμφοκυττάρου με IgMk. • ΜΚ-97: κύτταρα με έκφραση α4β1, αρνητικά για α5β1 και α6β1, με έκφραση δεικτών Β- λεμφοκυττάρου με IgAk. Βλαστικά κύτταρα οξειών λευχαιμιών: 8 οξείες μυελογενείς (1 MO, 3 ΜΙ, 2 M2, 1 M3, 1 Μ4) και 3 οξείες λεμφογενείς (2Β, 1Τ). Τα βλαστικά κύτταρα εκφράζουν τους ειδικούς δείκτες της τάξης τους και, σε ποικίλο βαθμό, ανεξάρτητα από το στάδιο διαφοροποίησής τους, τα μόρια προσκόλλησης α4β1 και α5β1, ενώ δεν εκφράζουν το μόριο α6β1. Η μεθοδολογία βασίζεται στην εναιώρηση κυττάρων με υψηλή ζωτικότητα σε θρεπτικό υγρό μέσο RPMI 1640 - Glutamax I και την τοποθέτησή τους επί επιφανειών επικαλυμμένων με φιμπρονεκτίνη ή λαμινίνη, σε συνδυασμό με αντίστοιχη τοποθέτηση σε επιφάνειες επικαλυμμένες με BSA (κύτταρα «μάρτυρες»). Η αρχική συγκέντρωση των κυττάρων αντιστοιχεί σε 120-500x105 κύτταρα/cm2. Αρχικά, εκτιμάται, με τη «δοκιμασία προσκόλλησης» για μία ώρα, το ποσοστό (%) προσκόλλησης των κυττάρων επί των πρωτεϊνικών επιφανειών, ενώ παράλληλα κύτταρα παραμένουν επί των πρωτεϊνικών επιφανειών (Fn, Lam, BSA) από 1-3 ή σε ορισμένες περιπτώσεις και περισσότερα 24ωρα, προκειμένου να ελεγχθεί η ανάπτυξή τους, ο φαινότυπος και η δυνατότητα προσκόλλησης επί αυτών. Τα αποτελέσματα, σε σύγκριση με τα κύτταρα μάρτυρες επί BSA, έδειξαν συνοπτικά τα κάτωθι. I. Δοκιμασίες επί φιμπρονεκτίνης. α) Κυτταρικές σειρές: Τα κύτταρα των σειρών ΚΓ-91 και ΚΑ-93 κατά τη «δοκιμασία προσκόλλησης» επί φιμπρονεκτίνης δεν εμφανίζουν προσκολλητικότητα. Κατά την παραμονή τους πέραν των 24 ωρών επί της «καθηλωμένης» φιμπρονεκτίνης, επάγεται και εντείνεται η έκφραση του μορίου α5β1, συνοδευόμενη από αύξηση της έκφρασης γλυκοφορίνης A και γ-αλύσου. Τα ευρήματα αυτά δεν ακολουθούν, τουλάχιστον εμφανή, προσκόλληση των κυττάρων επί φιμπρονεκτίνης. Οι σειρές διαφέρουν ως προς το ότι τα κύτταρα ΚΓ-91 επί φιμπρονεκτίνης εμφανίζουν στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξής τους στο 1° 24ωρο. Και στις δύο σειρές με την τεχνική ανάστροφης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) διαπιστώθηκε στα κύτταρα επί φιμπρονεκτίνης, συγκριτικά με τα αντίστοιχα κύτταρα επί BSA, πολλαπλάσια έκφραση των ε και γ γονιδίων σφαιρινικών αλύσων. Τα κύτταρα των σειρών ΖΑ-93 και ΜΚ-97, διαφορετικής λευχαιμικής προέλευσης, αλλά με τον ίδιο φαινότυπο Β-λεμφοκυττάρου, δεν εκδηλώνουν προσκολλητικότητα κατά τη «δοκιμασία προσκόλλησης». Στη διάρκεια παραμονής τους επί τρία 24ωρα σε φιμπρονεκτίνη, τα κύτταρα ΖΑ-93 δεν επηρεάζονται ενώ τα ΜΚ-97, χάνουν την ιντεγκρίνη α4β1 και εκφράζουν την α5β1, εμφανίζοντας δυνατότητα προσκόλλησης. Οι σημειούμενες διαφορές μεταξύ των σειρών και ιδιαίτερα μεταξύ αυτών με τον ίδιο φαινότυπο, αποκαλύπτουν και υπογραμμίζουν τη διαφορετική φύση των κυττάρων. β) Βλαστικά κύτταρα οξειών λευχαιμιών: Οι βλάστες των οξειών λευχαιμιών εκφράζουν, σε ποικίλο βαθμό, τις ιντεγκρίνες α4β1 και α5β1. Η έκφραση αυτή δε σχετίζεται με το στάδιο διαφοροποίησης, ούτε με τη δυνατότητα προσκόλλησης επί φιμπρονεκτίνης. Από τις 8 οξείες μυελογενείς λευχαιμίες, 4 έδειξαν κατά τη δοκιμασία προσκόλλησης, βαθμό προσκολλητικότητας κυμαινόμενο από 9-75% ενώ από τις οξείες λεμφογενείς λευχαιμίες, προσκόλληση εμφάνισαν 2 από τις 3 (προσκολλητικότητα 53% και 30% αντίστοιχα). Κατά την παραμονή τους επί των πρωτεϊνικών επιφανειών (φιμπρονεκτίνη και BSA), τα βλαστικά κύτταρα των οξειών μυελογενών λευχαιμιών, που διατήρησαν τη ζωτικότητά τους επί 3 ή και 5 24ωρα, παρουσιάζουν επίταση της έκφρασης του μορίου α5β1, με δυνατότητα προσκόλλησης επί φιμπρονεκτίνης, άσχετη με το αποτέλεσμα της δοκιμασίας προσκόλλησης. Σε 2 περιπτώσεις σημειώθηκε και επίταση ειδικών μυελικών δεικτών ενδεικτικών διαφοροποίησης. II. Δοκιμασίες επί λαμινίνης. Τόσο τα κύτταρα των λευχαιμικών σειρών, όσο και τα βλαστικά των οξειών λευχαιμιών δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α6β1, η οποία αποτελεί μόριο προσκόλλησης για τη λαμινίνη. Οι «δοκιμασίες προσκόλλησης» των κυττάρων και των 4 σειρών, καθώς και των βλαστών από οξεία μυελογενή λευχαιμία M3, ήταν αρνητικές. Κατά την παραμονή των κυττάρων επί 3 24ωρα επί λαμινίνης, δεν προκλήθηκε έκφραση της α6β1 ή διαφορά στην ανάπτυξη και το φαινότυπο των κυττάρων. Από τη συνεκτίμηση των αποτελεσμάτων της μελέτης, εξάγονται τα ακόλουθα συμπεράσματα: • Από τα πειράματα επί των σειρών με ερυθροειδή χαρακτηριστικά, διαφαίνεται η γνωστή ιδιαίτερη σχέση της φιμπρονεκτίνης με την ερυθροειδή διαφοροποίηση, η οποία, στη συγκεκριμένη μελέτη, εκδηλώνεται με επίταση της έκφρασης της γλυκοφορίνης Α, καθώς και επίταση της αιμοσφαιρινοσύνθεσης, γεγονός που επισημαίνεται για πρώτη φορά. • Διαπιστώνεται η ευ μεταβλητότητα των ιντεγκρινών α4β1 και α5β1 και η επαγωγή της έκφρασης, ιδίως της α5β1, από τη φιμπρονεκτίνη. • Η έκφραση και η λειτουργικότητα των μορίων προσκόλλησης επί των λευχαιμικών βλαστών, ποικίλει και δε σχετίζεται με το είδος της λευχαιμίας. Το στοιχείο αυτό πιθανώς οφείλεται στην ετερογένεια των λευχαιμιών. Σε αντίθεση με τη φιμπρονεκτίνη, η λαμινίνη δε φαίνεται να επάγει την έκφραση του ειδικού για αυτή μορίου προσκόλλησης α6β1. Η ποικιλία όμως των υποτύπων της λαμινίνης δεν επιτρέπει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων.