Ανάπτυξη συνθετικών πεπτιδίων και αντισωμάτων για τη μελέτη του νευροπροστατευτικού 24 - πεπτιδίου ουμανίνη ( Humanin )

Abstract

Humanin (HN, MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA) is a neuroprotective 24-mer peptide discovered in 2001. HN was found to abolish in vitro the death of neuronal cells induced by mutations related to the familial form of Alzheimer’s disease (AD) as well as by other causes leading to AD development. Later, HN was found to exert a broader in vitro cytoprotective action. In vivo HN and its active derivatives were found to reverse learning and memory impairment that was experimentally induced in suitable mice or rat models. The biological activity of HN seems to be strongly related to its primary structure. For example, substitution of Ser14 by Gly leads to the peptide HNG (HN[Gly14]), which has a 103-fold higher activity in comparison to HN, whereas the derivative AGA-(C8R)HNG17 seems to be 106-fold more potent. Until now, the most potent derivative of HN is Colivelin, which is 108-fold more active than HN. The exact mechanism through which HN exerts its biological action remains unclear. According to biological studies reported in the literature, HN seems to be produced in vivo, secreted through the endoplasmatic reticulum and Golgi secretary pathway and act outside of the cell, through putative cell surface receptors. On the other hand, HN may also exert its action inside the cell, interfering with apoptotic proteins and thus suppressing cell apoptosis. In the frames of the present work the following tasks were accomplished: 1. Synthesis of i) HN, ii) known from the literature, biologically active derivatives of HN and, iii) new derivatives of HN with potentially high biological activity. Some of the above synthetic peptides were used by collaborating groups in in vivo behavioral studies and in structural studies. 2. Application of certain synthetic derivatives of HN, labeled with the radioisotope 125I, to preliminary biological in vitro cell-binding studies and in vivo biodistribution studies. 3. Synthesis of HN as well as of possibly antigenic HN-derivatives and, consequently, development and evaluation of the antibodies raised against them. Utlimate goal is to use these antibodies in the immunodetection of HN in biological samples. More specifically, in the present study the 24-mer peptide humanin and twelve different peptide derivatives of HN were synthesized. The HN-derivatives selected for synthesis have substitutions, insertions or deletions of aminoacids at several positions of the parental peptide HN. The peptides were synthesized following the Fmoc/t-Bu solid phase strategy. The synthetic peptides were purified with semi-preparative RP-HPLC, characterized with analytical RP-HPLC and identified with ESI-MS. The final synthetic products were of high purity. During synthesis of all the above peptides, slow deprotection of the Nα-protecting group was observed at the region Arg4-Leu10. The synthetic derivatives Tyr-des-Leu-AGA(C8R)-HNG17 (Υ-ΗΝ5) and Tyr-des-Leu-Colivelin (Y-HN8), which contain a Tyr residue at their N-terminus, were radiolabeled with 125I (Czech Academy of Sciences) and were used in preliminary in vitro cell-binding studies using the cell lines neuro-2A, SY5Y, HT22, U87Mg as well as cell membranes isolated from murine brain and stomach tissues. According to preliminary results, low binding of 125Ι-Υ-ΗΝ8 onto membranes isolated from the stomach tissues was observed. The radiolabeled derivatives 125Ι-Υ-ΗΝ5 and 125Ι-Υ-ΗΝ8 were also used in preliminary in vivo biodistribution studies in Swiss albino mice (Radiopharmaceutical Chemistry Laboratory, NCSR “Demokritos”). According to preliminary results, it is quite interesting that radioactivity was accumulated in the stomach 2 h after intravenous administration of the radiolabeled peptides. Moreover, in the present study, different antibodies for HN were developed and evaluated, using different immunogens. In particular, New Zealand white rabbits were immunized against: - synthetic HN, non conjugated to an immunogenic carrier-protein [HN], - synthetic HN conjugated to the immunogenic carrier-protein KLH using the glutaraldehyde method [HN/KLH(1)], - synthetic HN conjugated to KLH using (4-N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic-3-sulfo-N-hydroxysuccinimidoester (sulfo-SMCC) [HN/KLH(2)], - a synthetic C-terminal peptide derivative of HN (consisting of Asp17-Ala24 and having an additional Lys residue at the N-terminal and whose Lys21 is Nε-acetylated) conjugated to KLH using the glutaraldehyde method [C1-HN/KLH], - a synthetic C-terminal peptide derivative of HN (consisting of Asp17-Ala24 and having an additional Lys residue at the N-terminal) conjugated to KLH using the glutaraldehyde method [C2-HN/KLH], - a synthetic Ν-terminal derivative of HN (consisting by Met1-Ser7 and having aminocaproic acid at its C-terminus) conjugated to KLH using the carbodiimide method [Ν-HN/KLH], - synthetic HN, which has at its N-terminus a “dendrimer” consisting of three Lys residues...

Η ουμανίνη (humanin ή HN, MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA) είναι ένα 24-πεπτίδιο που ανακαλύφθηκε το 2001 ως το προϊόν έκφρασης ενός γονιδίου με νευροπροστατευτική δράση. Συγκεκριμένα, η ΗΝ βρέθηκε να αποτρέπει in vitro το θάνατο των νευρικών κυττάρων που προκαλείται από μεταλλάξεις σχετιζόμενες με την οικογενή μορφή της νόσου Alzheimer και από άλλα αίτια που οδηγούν στην εμφάνισή της. Αργότερα, αναφέρθηκε ότι η ΗΝ ασκεί ευρύτερη in vitro κυτταροπροστατευτική δράση. Ιn vivo η ΗΝ καθώς και δραστικά της παράγωγα βρέθηκαν ότι βελτιώνουν τα προβλήματα μάθησης και μνήμης που δημιουργούνται σε πειραματικά μοντέλα ποντικών ή αρουραίων. Η βιολογική δράση της ΗΝ φαίνεται να εξαρτάται σημαντικά από την πρωτοταγή δομή του μορίου της. Με αντικατάσταση, π.χ., της Ser14 από Gly προκύπτει το πεπτίδιο HNG (HN[Gly14]), που παρουσιάζει αυξημένη δραστικότητα κατά 103 φορές σε σχέση με την ΗΝ, ενώ το παράγωγο AGA-(C8R)HNG17 φαίνεται να είναι δραστικότερο κατά 106 φορές. Το πιο δραστικό, μέχρι στιγμής, παράγωγο της ΗΝ είναι η κολιβελίνη (Colivelin), η οποία παρουσιάζει αυξημένη δραστικότητα κατά 108 φορές σε σχέση με την ΗΝ. Ο μηχανισμός με τον οποίο η ΗΝ και τα παράγωγά της ασκούν τη βιολογική τους δράση παραμένει αδιευκρίνιστος. Σύμφωνα, πάντως, με αναφορές της βιβλιογραφίας, η ΗΝ φαίνεται ότι συντίθεται in vivo, εκκρίνεται στην κυκλοφορία και δρα εξωκυτταρικά, μέσω υποδοχέων στην επιφάνεια των κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, η ΗΝ πιθανόν να ασκεί και ενδοκυττάρια δράση, δρώντας στους μηχανισμούς ενεργοποίησης αποπτωτικών πρωτεϊνών και καταστέλλοντας έτσι την κυτταρική απόπτωση. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε: 1. Σύνθεση i) ΗΝ, ii) γνωστών από τη βιβλιογραφία, δραστικών πεπτιδικών παραγώγων της ΗΝ, και, iii) νέων παραγώγων της ΗΝ με εν δυνάμει υψηλή βιολογική δραστικότητα. Ορισμένα από τα παραπάνω συνθετικά πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν από συνεργαζόμενες ερευνητικές ομάδες σε in vivo βιολογικές μελέτες συμπεριφοράς καθώς και σε μελέτες δομής. 2. Εφαρμογή συγκεκριμένων συνθετικών παραγώγων της ΗΝ, επισημασμένων με το ραδιοϊσότοπο 125Ι, σε προκαταρκτικές βιολογικές μελέτες in vitro κυτταρικής δέσμευσης και in vivo βιοκατανομής. 3. Σύνθεση ΗΝ καθώς και πεπτιδικών παραγώγων της με πιθανή αντιγονική δράση και, στη συνέχεια, ανάπτυξη αντισωμάτων εναντίον τους, με άμεσο στόχο την αξιολόγησή τους και απώτερο την εφαρμογή τους σε συστήματα ανοσοανίχνευσης της ΗΝ σε βιολογικά δείγματα. Συγκεκριμένα, στα πλαίσια της διατριβής συνετέθη το 24-πεπτίδιο ουμανίνη και δώδεκα διαφορετικά πεπτιδικά παράγωγα του μητρικού πεπτιδίου. Τα πεπτιδικά παράγωγα που επιλέχθηκαν για σύνθεση προέκυψαν με αντικατάσταση, προσθήκη ή απομάκρυνση αμινοξέων σε διάφορες θέσεις του μητρικού πεπτιδίου ΗΝ. Η σύνθεση έγινε σε στερεά φάση, με την Fmoc/t-Bu στρατηγική. Τα συνθετικά πεπτίδια καθαρίστηκαν με ημι-παρασκευαστική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, ανάστροφης φάσης (RP-HPLC), χαρακτηρίστηκαν με αναλυτική RP-HPLC και ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο της φασματομετρίας μαζών μετά από ιοντισμό με ηλεκτροψεκασμό (ESI-MS). Τόσο η ΗΝ όσο και τα συνθετικά πεπτιδικά της παράγωγα παρελήφθησαν σε υψηλή καθαρότητα. Κατά τη σύνθεση όλων των παραπάνω πεπτιδίων παρατηρήθηκε αργή αποπροστασία της Να-προστατευτικής ομάδας στην περιοχή Arg4-Leu10. Τα συνθετικά παράγωγα Tyr-des-Leu-AGA(C8R)-HNG17 (Υ-ΗΝ5) και Tyr-des-Leu-Colivelin (Y-HN8), που περιέχουν ένα αμινοξύ τυροσίνης στο Ν-τελικό άκρο τους, ραδιοεπισημάνθηκαν με 125Ι (Ακαδημία Επιστημών της Τσεχίας) και χρησιμοποιήθηκαν σε προκαταρκτικές in vitro μελέτες δέσμευσης στις κυτταρικές σειρές neuro-2A, SY5Y, HT22, U87Mg και σε μεμβράνες απομονωμένες από ιστούς εγκεφάλου και στομάχου ποντικών Swiss albino. Σύμφωνα με τα πρώτα αποτελέσματα, παρατηρήθηκε μικρή δέσμευση του παραγώγου 125Ι-Υ-ΗΝ8 στις μεμβράνες των ιστών στομάχου. Τα ραδιοεπισημασμένα παράγωγα 125Ι-Υ-ΗΝ5 και 125Ι-Υ-ΗΝ8 χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε προκαταρκτικές in vivo μελέτες βιοκατανομής σε ποντικούς Swiss albino (Εργαστήριο Ραδιοφαρμακευτικής Χημείας, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»). Σύμφωνα με τα πρώτα αποτελέσματα, ενδιαφέρον παρουσιάζει ο εντοπισμός ραδιενέργειας στο στομάχι των ποντικών 2 h μετά από ενδοφλέβια χορήγηση των παραγώγων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε επίσης ανάπτυξη και αξιολόγηση διαφορετικών αντισωμάτων για την ΗΝ, με τη χρήση διαφορετικών ανοσογόνων. Συγκεκριμένα, έγιναν ανοσοποιήσεις έναντι: - συνθετικής ΗΝ, μη συζευγμένης σε ανοσογονική πρωτεΐνη-φορέα, - συνθετικής ΗΝ συζευγμένης στην ανοσογονική πρωτεΐνη-φορέα KLH μέσω γλουταραλδεΰδης [HN/KLH(1)], - συνθετικής ΗΝ συζευγμένης σε ΚLH μέσω του αντιδραστηρίου (4-N-μηλεϊμιδομεθυλ) κυκλοεξαν-1-καρβοξυλο-3-σουλφο-N-υδροξυηλεκτριμιδοεστέρα (sulfo-SMCC) [HN/KLH(2)]...