Ανάπτυξη μεθοδολογίας και οργανολογίας για το φασματοσκοπικό χαρακτηρισμό χρωστικών (από πέταλα φυτών). Εφαρμογές πεδίου: μέτρηση φασμάτων ηλεκτρονικής απορρόφησης και φθορισμού σε άθικτα πέταλα (in situ) με οπτικές ίνες

Abstract

Lately there is a considerable demand for natural products including pigments. Following this demand for new resources of natural colorants, it was investigated in this study the detection and identification of the pigments from red, pink and white flower petals of Nerium oleander L. A protocol based on classical chemical procedures was used consisted by three major steps; extraction, purification and analysis of the extracts. The acidic aqueous and/or methanolic extracts from red, pink and white flower petal were purified by a solid phase extraction procedure. High-Performance liquid chromatography diode array detection analysis showed that all the extracts are constituted by two components (pigments); ~95% cyaniding-3-rutinoside and ~5% cyanidin-3-glucoside. It was also detected the presence of four colourless flavonoids. The sugar configuration was determined via NMR and 2D-NMR spectra of the extracts. For the main pigment the signals of the anomeric protons suggest that the glucose residue compromise a β-D-glucopyranose, and in the rhamnose moiety suggested the existence of an α-L-rhamnopyranose. The structure of the pigments and of colorless quercetin-3-rutinose was identified also through MS and MS-MS spectrometry. The spectroscopic fingerprint of the pigments was obtained via extended spectroscopic studies (UV-vis, fluorescence spectroscopy, circular dichroism). Concentration, pH, and solvent effects were examined. Measurements were also performed in intact flower petals with non destructive techniques; Laser Induced Fluorescence (LIF) and Diffuse Reflectance Spectroscopy. The fluorescence spectra were obtained via experimental set up equipped with pulse laser. The emission spectra recorded at excitation wavelength 355nm and 532nm, showed one broad emission band at 640nm assigned to anthocyanins after latter matching with the fluorescence emission and fluorescence excitation spectra of the extracts. The absorptance of the intact flower petals was calculated by measuring the transmittance and the reflectance. The band shown at 540nm corresponds at the total anthocyanin content. MS and LIF spectra of intact white petals and extracts indicate the presence of the same pigments in traces. From the chemical studies and the non destructive methods it is concluded that the stability of the pigments in vivo depends on the pH of the cell, the concentration, and the presence of co-pigments (flavonoids). The variation of colours is a result of different cell pH and pigment concentration in every sample. The fact that only one major pigment (cyanidine 3-rutinoside) is responsible for the colour of the flower petals of Nerium oleander L. make this plant a new and good source for natural pigments. From 10g of dried red1 petals 10mg of cyaniding-rutinoside were isolated. This is the first time that the anthocyanin composition of Nerium oleander L. flower petals has been described.

Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον για φυσικά προϊόντα και κατά συνέπεια για φυσικές χρωστικές είναι αυξημένο. Με δεδομένη την ανάγκη για νέες πηγές χρωστικών στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η δυνατότητα προσδιορισμού και απομόνωσης τέτοιων ενώσεων από ερυθρά (διάφορων αποχρώσεων) και λευκά πέταλα του άνθους της Πικροδάφνης (Nerium oleander L.). Με χρήση κλασικών χημικών τεχνικών αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο που περιλαμβάνει την εκχύλιση των χρωστικών, τον καθαρισμό και εν συνεχεία την ανάλυση αυτών. Τα όξινα μεθανολικά εκχυλίσματα που περιέχουν τις ανθοκυανίνες καθαρίστηκαν με την τεχνική εκχύλισης στερεής φάσης (solid phase extraction). Η απομόνωση και ο διαχωρισμός έγινε με υγροχρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Σύμφωνα με τα χρωματογραφήματα όλα τα «έγχρωμα» δείγματα περιέχουν ακριβώς τις ίδιες χρωστικές σε σχεδόν ίδια αναλογία (~95% κυανιδίνη-3-ρουτινόζη, και 5% κυανιδίνη-3-γλυκόζη). Στα εκχυλίσματα εκτός των χρωστικών υπάρχουν ακόμα τέσσερα συστατικά τα οποία αποδίδονται σε φλαβονοειδή (άχρωμες ενώσεις). Από τη μελέτη με NMR και 2D NMR πιστοποιήθηκε η δομή της κύριας χρωστικής και επιπροσθέτως καθορίστηκε για το δισκαχαρίτη πως το κομμάτι της γλυκόζης παρουσιάζει διευθέτηση τύπου β και το κομμάτι της ραμνόζης διευθέτηση τύπου α. Από τη μελέτη με φασματομετρία μάζας (MS και MS-MS) έγινε ταυτοποίηση της δομής των χρωστικών, επιβεβαιώθηκε πως το ανθοκυανικό περιεχόμενο είναι το ίδιο για όλα τα δείγματα και προσδιορίστηκε η δομή ενός εκ των φλαβονοειδών (κερκετίνη-3-ρουτινόζη). Επιπλέον πραγματοποιήθηκε εκτενής φασματοσκοπική μελέτη (UV-vis, φθορισμός, κυκλικός διχρωισμός) όλων των εκχυλισμάτων και πρότυπων ενώσεων. Μελετήθηκαν οι επιδράσεις σε μεταβολές του pH, της συγκέντρωσης, και του διαλύτη με σκοπό την καταγραφή του φασματοσκοπικού αποτυπώματος των εκχυλισμάτων. Μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε άθικτα πέταλα με μη καταστρεπτικές τεχνικές: φασματοσκοπία εκπομπής φθορισμού επαγόμενου από λέιζερ (LIF) και φασματοσκοπία διάχυτης ανάκλασης. Για την καταγραφή φασμάτων εκπομπής φθορισμού αναπτύχθηκε πειραματική διάταξη με παλμικό λέιζερ. Στα φάσματα εκπομπής που καταγράφηκαν με διέγερση στα μήκη κύματος 355nm και 532nm, ανιχνεύεται μέσω οπτικής ίνας εκπομπή με μέγιστο στα 640nm η οποία αποδόθηκε στο ολικό ανθοκυανικό περιεχόμενο έπειτα από συσχέτιση με τα αντίστοιχα φάσματα εκπομπής φθορισμού και εκπομπής διέγερσης που ελήφθησαν για τα εκχυλίσματα και πρότυπες ενώσεις. Από μετρήσεις διαπερατότητας και διάχυτης ανάκλασης υπολογίστηκαν τα φάσματα απορρόφησης για τα άθικτα πέταλα. Η ευρεία ταινία που εντοπίζεται με μέγιστο στα 540nm οφείλεται στις ανθοκυανίνες. Από τα φάσματα MS στα εκχυλίσματα και από τα φάσματα φθορισμού σε άθικτα πέταλα υπάρχουν ενδείξεις πως οι χρωστικές υπάρχουν έστω και σε ίχνη στα λευκά πέταλα. Τόσο από τις μετρήσεις σε άθικτα πέταλα όσο και από τις μελέτες των αντίστοιχων εκχυλισμάτων προκύπτει πως η σταθεροποίηση των χρωστικών στους φυτικούς ιστούς και κατά συνέπεια το χρώμα των πετάλων εξαρτώνται από το pH εντός των κυττάρων, την αλληλεπίδραση με τις συγχρωστικές (φλαβονοειδή) και από τη συγκέντρωση. Οι παράγοντες του pH και της συγκέντρωσης είναι μεταβλητοί και ευθύνονται για τις χρωματικές διαφοροποιήσεις κάθε δείγματος. Το γεγονός της εμφάνισης μιας ουσιαστικά κύριας χρωστικής καθιστά τα πέταλα της πικροδάφνης μια νέα, πολύ ελκυστική, πηγή αυτής της ένωσης. Για τα πέταλα red1 ειδικότερα από 10g ξηρού δείγματος απομονώνονται 10mg κυανιδίνης-3-ρουτινόζη.Είναι η πρώτη φορά που πραγματοποιείται ο χαρακτηρισμός των χρωστικών των πετάλων του άνθους της πικροδάφνης (Nerium oleander L.).