Μελέτη δομικών μεταβολών σε πρωτεϊνικά μόρια με τη χρήση της τεχνικής της αδιαβατικής θερμιδομετρίας διαφορικής σάρωσης: θερμοδυναμική με βάση τη δομή σταθερότητα της λειτουργικής περιοχής brct των πρωτεϊνών brca1, bard1 και 53bp1

Abstract

Tandem BRCT repeats are phosphopeptide-binding modules found in several proteins that participate in transcriptional activation networks, DNA-damage checkpoint control and genomic stability. The BRCA1-associated RING domain protein 1 (BARD1) is a 777 amino acid-long protein that contains a RING finger, three ankyrin repeats and the BRCT domain. It is the major binding partner of the breast and ovarian tumor suppressor BRCA1, functioning by forming a heterodimer with BRCA1. 53BP1 is another protein with a BRCT domain that plays an important role in the cellular response to DNA damage. 53BP1 interacts with the DNA-binding core domain of the tumor suppressor p53 and enhances p53-mediated transcriptional activation. The interaction between p53 and 53BP1 is mediated by the C-terminal BRCT domain. It has been shown that thermodynamic destabilization of the BRCT domain of BRCA1 is induced by missense mutations linked to hereditary breast-ovarian cancer. To gain insight into the differential thermodynamic stability of the BRCT domains of BRCA1, BARD1 and 53BP1, a series of biophysical techniques were employed to analyze their thermodynamic stability by chemical and thermal unfolding. To this end recombinant 6xHis fusion tagged BARD1 and 53BP1- BRCT proteins were overexpressed in E. coli. To enable the characterization of these proteins via calorimetric and spectroscopic studies, the 6xHis fusion tag was enzymatically removed and the native proteins were purified to homogeneity. These proteins have been subjected to circular dichroism, differential scanning calorimetry and fluorescence spectroscopy. Finally, to investigate whether the BARD1- BRCT domain interacts with the BRIP1 phosphopeptide, a series of isothermal titration experiments was performed under solution conditions that maximize the stability of the domain. Interestingly, in 50 mM Borate pH 9.0, 300 mM NaCl and at 10°C, it was possible to record an interaction with the BRIP1 phosphopeptide. This is the first report of an interaction of the BARD1- BRCT domain with a pSer-X-X-Phe motif phosphopeptide, a result which underlines the major role of thermodynamic stability in protein-protein interactions and explains the different binding preferences of these BRCT domains.

Οι επαναλήψεις BRCT είναι δομικά πρωτεϊνικά στοιχεία με ικανότητα δέσμευσης φωσφοπεπτιδίων που εμφανίζονται συχνά σε πρωτεΐνες που συμμετέχουν στα δίκτυα ενεργοποίησης της μεταγραφής, σε κρίσιμα σημεία ελέγχου βλαβών του DNA και στη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιόματος. Η BARD1 είναι μια πρωτεΐνη 777 αμινοξικών καταλοίπων που περιέχει μια RING δομική περιοχή, τρείς επαναλήψεις αγκυρίνης και μια περιοχή BRCT. Είναι η πιο σημαντική από τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με το ογκοκατασταλτικό μόριο BRCA1, μόριο με το οποίο σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με μεγάλη βιολογική δραστικότητα. Η 53BP1 είναι μια ακόμα πρωτεΐνη που διαθέτει BRCT δομική περιοχή και που διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στις κυτταρικές αποκρίσεις που ακολουθούν τον εντοπισμό βλαβών στο DNA. Η 53BP1 αλληλεπιδρά με τη DNA-δεσμευτική περιοχή της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 και ενισχύει την p53-εξαρτώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση. Η αλληλεπίδραση μεταξύ της p53 και της 53BP1 πραγματοποιείται μέσω της BRCT περιοχής της τελευταίας. Έχει διαπιστωθεί ότι η θερμοδυναμική αποσταθεροποίηση της περιοχής BRCTBRCA1, σαν αποτέλεσμα της παρουσίας παρανοηματικών μεταλλαγών στο μόριο, συνδέεται με τον κληρονομικό καρκίνο μαστού-ωοθηκών. Με στόχο την αποτίμηση της θερμοδυναμικής σταθερότητας των περιοχών BRCT των πρωτεϊνών BARD1 και 53BP1, πραγματοποιήθηκε μια σειρά βιοφυσικών πειραμάτων για την ανάλυση της θερμικά και χημικά επαγόμενης αποδιάταξης των μορίων αυτών. Αρχικά οι επισημασμένες με ετικέτα ιστιδινών (6xHis) πρωτεΐνες BARD1 και 53BP1-BRCT υπερεκφράστηκαν σε καλλιέργειες βακτήριων Ε. coli. Για τη πραγματοποίηση θερμιδομετρικών και φασματοσκοπικών μελετών κρίθηκε απαραίτητη η αποκοπή της ετικέτας ιστιδινών, η οποία και πραγματοποιήθηκε ενζυμικά και στη συνέχεια ακολούθησε απομόνωση και καθαρισμός των πρωτεϊνικών μορίων. Οι πρωτεΐνες αυτές μελετήθηκαν με κυκλικό διχροϊσμό, αδιαβατική μικροθερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης και φασματοσκοπία φθορισμού. Τέλος, προκειμένου να ερευνηθεί εάν η περιοχή BARD1-BRCT αλληλεπιδρά με το φωσφοπεπτίδιο BRIP1, μια σειρά πειραμάτων θερμιδομετρίας ισόθερμης τιτλοδότησης πραγματοποιήθηκε σε συνθήκες που μεγιστοποιούν τη σταθερότητα της δομικής αυτής περιοχής. Κατά τρόπο ενδιαφέροντα, σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM βορικών pH 9.0, 300 mM ΝaCl και σε θερμοκρασία 10°C, ήταν δυνατό να καταγραφεί αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης BARD1-BRCT με το φωσφοπεπτίδιο BRIP1. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά στη διεθνή βιβλιογραφία μιας αλληλεπίδρασης της BARD1-BRCT περιοχής με φωσφοπεπτίδιο δομικού μοτίβου pSerX-X-Phe, ένα αποτέλεσμα που υπογραμμίζει το σημαντικό ρόλο της θερμοδυναμικής σταθερότητας στις πρωτεϊνικές-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και εξηγεί τις διαφορές που παρουσιάζουν οι περιοχές αυτές όσον αφορά τη δέσμευση φωσφοπεπτιδίων.