Γενετική μελέτη οικογενών μορφών βλεφαρόπτωσης

Abstract

Introduction Mitochondrial disorders or mitochondriopathies is the term used to describe diseases which are due to respiratory chain protein complex deficiencies which consequently lead to impaired cell oxygen utilization and reduced energy production. They usually show a chronic, slowly progressive course and present with multi-organ involvement with varying onset between birth and late adulthood. Mitochondriopathies are caused by either sporadic or inherited mutations in nuclear or mitochondrial DNA located genes (primary MCPs), or by exogenous factors (secondary MCPs). The most common manifestation of mitochondrial dysfunction is chronic progressive external ophthalmoplegia (CPEO), propably because of the high concentration of mitochondria in the extraocular muscles. It is a painless, slowly progressive disorder involving all the extraocular muscles, leading to complete ocular immobility. It mainly presents with ptosis and weakness of the extraocular muscles and the onset may vary from childhood to late adulthood. Sporadic cases of CPEO are due to mtDNA rearrangements (deletions, duplications), whether familial cases of CPEO are due to mutations in nuclear DNA genes. So far mutations in four nuclear genes have been associated with CPEO. These are POLG; POLG2; ANT1 and TWINKLE Materials and methods Members of three Greek families from the region of Thessaly (Greece), presenting with ptosis and/or external ophthalmoplegia where examined. All families’ members which were available underwent clinical examination and history review. Blood samples were also taken for nuclear DNA extraction. Two patients from different families underwent muscle biopsy for histology and histopathology examinations. The molecular investigation involved Southern blot analysis and long-range polymerase chain reaction (PCR) of the muscle DNA, DNA sequencing and restriction fragment length polymorphisms (RFLP). Results For patient 1 PCR analysis showed the presence of multiple PCR products probably corresponding to deletions. Southern blot analysis showed a pattern of multiple mtDNA deletions. DNA sequencing revealed a novel autosomal mis-sence mutation in TWINKLE gene (R334P). The new mutation was verified by PCR-RFLP. The segregation study showed an autosomal dominant pattern of inheritance. This is the first confirmed TWINKLE mutation in familial CPEO in a Greek family to be reported. For patient 2 PCR analysis showed the presence of multiple PCR products probably corresponding to deletions. Southern blot analysis showed a faint and smeared hybridization signal above the wild-type mtDNA band. DNA sequencing did not reveal a mutation in any of the four nuclear genes involved in CPEO.

Εισαγωγή Ως μιτοχονδριακές εγκεφαλομυοπάθειες(ΜΕ) ή μιτοχονδριοπάθειες αναφέρονται οι ασθένειες που οφείλονται σε ανεπάρκεια των πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων της αναπνευστικής αλύσου που έχει σαν αποτέλεσμα την ανεπαρκή κατανάλωση οξυγόνου και τη μειωμένη παραγωγή ενέργειας. Η πορεία τους είναι συνήθως αργή και προοδευτική, παρουσιάζουν πολυσυστηματικές εκδηλώσεις και η ηλικία έναρξης ποικίλει από τη γέννηση έως πολύ προχωρημένες ηλικίες. Οι ΜΕ προκαλούνται από σποραδικές ή κληρονομούμενες μεταλλάξεις σε μιτοχονδριακά ή πυρηνικά γονίδια (πρωτοπαθείς ΜΕ) ή από εξωγενείς παράγοντες (δευτεροπαθείς ΜΕ). Η πιο συνήθης εκδήλωση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας είναι η προοδευτική εξωτερική οφθαλμοπληγεία (chronic progressive external ophthalmoplegia, CΡΕΟ), πιθανώς λόγω της υψηλής συγκέντρωσης μιτοχονδρίων στους εξοφθάλμιους μύες. Πρόκειται για μία ανώδυνη, αργά εξελισσόμενη νόσο στην οποία εμπλέκονται όλοι οι εξοφθάλμιοι μύες και που σταδιακά οδηγεί στην πλήρη ακινησία του οφθαλμού. Κυρίως παρουσιάζεται με πτώση βλεφάρου και αδυναμία των εξοφθάλμιων μυών και η ηλικία έναρξης ποικίλει από την παιδική έως την έκτη δεκαετία. Οι σποραδικές μορφές CΡΕΟ οφείλονται σε ελλείμματα ή διπλασιασμούς στο μιτοχονδριακό DNA (mitochondrial DNA, mtDNA), ενώ οι οικογενείς μορφές της νόσου οφείλονται σε μεταλλάξεις γονιδίων του πυρηνικού DNA (nuclear DNA, nDNA). Έως σήμερα έχουν εντοπιστεί μεταλλάξεις σε τέσσερα πυρηνικά γονίδια, τα οποία συνδέονται με CΡΕΟ. Αυτά είναι: POLG, POLG2, ANT1 και TWINKLE Υλικό και μέθοδοι Εξετάστηκαν τα μέλη τριών οικογενειών Ελληνικής καταγωγής από την ευρύτερη περιοχή της Θεσσαλίας, που παρουσίασαν πτώση βλεφάρου και/ή εξωτερική οφθαλμοπληγία. Όλα τα μέλη που ήταν διαθέσιμα υπεβλήθησαν σε κλινική εξέταση και λήψη ιστορικού. Έγιναν επίσης αιμοληψίες με σκοπό την εξαγωγή nDNA. Δύο ασθενείς από διαφορετικές οικογένειες υπεβλήθησαν σε βιοψία μυός με σκοπό τον περαιτέρω ιστολογικό και ιστοχημικό έλεγχο. Ο μοριακός έλεγχος περιελάμβανε Southern blot ανάλυση του μυϊκού DNA, προσδιορισμό αλληλουχίας βάσεων DNA και επιβεβαίωση της μετάλλαξης με πολυμορφισμό μήκους θραύσματος (RFLP). Αποτελέσματα Στον ασθενή 1 η PCR ανάλυση ανέδειξε την παρουσία πολλαπλών PCR προϊόντων που πιθανώς αντιστοιχούν σε ελλείμματα. Η Southern blot ανάλυση έδειξε πρότυπο πολλαπλών mtDNA ελλειμμάτων. Ο DNA προσδιορισμός αλληλουχίας απεκάλυψε μία νέα αυτοσωμική παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο TWINKLE γονίδιο (R334P). Η νέα μετάλλαξη επιβεβαιώθηκε με πολυμορφισμό μήκους θραύσματος. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας έδειξε αυτοσωμικό επικρατές μοντέλο κληρονόμησης. Αυτή είναι η πρώτη επιβεβαιωμένη TWINKLE μετάλλαξη σε οικογενή CΡΕΟ σε ελληνική οικογένεια. Στον ασθενή 2 η PCR ανάλυση ανέδειξε την παρουσία πολλαπλών PCR προϊόντων που πιθανώς αντιστοιχούν σε ελλείμματα. Η Southern blot ανάλυση έδειξε ένα τυπικό πρότυπο που παρατηρείται σε σύνδρομα πολλαπλών mtDNA ελλειμμάτων, αλλά και ένα εξασθενημένο και επικολλημένο σήμα υβριδισμού πάνω από τη ζώνη του υγιούς τύπου mtDNA. Ο DNA προσδιορισμός αλληλουχίας δεν ανέδειξε κάποια μετάλλαξη σε κάποιο από τα τέσσερα πυρηνικά γονίδια που συνδέονται με CΡΕΟ.