Διαμορφωτική ανάλυση πεπτιδικών αναλόγων του επιτόπου 87-99 της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης (MBP) καθώς και προσομοίωση μοριακής δυναμικής των συμπλόκων τους με τον υποδοχέα HLA-DR2b

Abstract

Multiple Sclerosis (MS) is a myelin-specific CD4+ T-cell mediated autoimmune disease. Antigen-specific therapies that suppress autoreactive T cells or switch the immune response from Th1 to Th2 are a novel approach towards its therapeutic management. The most important constituent of myelin sheath is Myelin Basic Protein (MBP) and it has been considered as a candidate autoantigen, supported by evidence depicting that MBP72-85 has the potential of inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE, animal model of MS) when injected in Lewis rats. Within the grounds of actively inhibit the disease, the design and use of Altered Peptide Ligands (APLs) of MBP has been suggested, interfering with the formation of the trimolecular complex MHC-APL-T-cell Receptor (TCR). Inference to a series of EAE experiments is that the linear APLs [Arg91,Ala96]MBP87-99 and [Ala91,96]MBP87-99 as well as the cyclic APLs cyclo(87-99)[Arg91,Ala96]MBP87-99, cyclo(87-99)[Ala91,96]MBP87-99, and cyclo(91-99)[Ala96]MBP87-99 hold antagonistic activity. We performed conformational analysis of the APLs in order to understand the physicochemical and structural properties required for antagonistic biological activity. A combination of 2D NMR in DMSO-d6 and molecular dynamics was applied in MOE and DYANA software. Putative bioactive conformations were proposed, i.e. conformations that enable binding with the HLA, but prevent strong binding to the TCR and therefore T-cell activation. These conformations were then used as starting points for binding with the MHC-DRB1*1501 isolated from pdb: 1ymm. The APL-MHC complexes were subjected to large scale molecular dynamics in solvent using GROMACS, and the same procedure was applied to the MPB85-98 - MHC complex (1ymm), allowing direct comparison of results for agonist (EAE-inducing) and antagonist peptides (EAE-preventing). The network of hydrogen bonds between the peptide backbone and the active site, the non bonded intermolecular interactions of peptide side chains and the pockets of the binding site, and the solvent accessible surface area (SASA) of the bound peptides were studied. From these calculations, a structural motif for antagonistic activity was sought. Based on our conclusions, a set of pharmacophore groups was established, and a 3D database search was performed. A hit was found, rational drug design was applied, and a molecule with putative antagonistic activity was proposed.

Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (Multiple Sclerosis - MS) είναι μία φλεγμονώδης ασθένεια αδιευκρίνιστης αιτιολογίας η οποία χαρακτηρίζεται από απομυελίνωση τμημάτων των νευρικών κυττάρων και αναστολή ή πλήρη διακοπή της μετάδοσης των νευρικών ερεθισμάτων. Στην παθοφυσιολογία της νόσου εμπλέκονται τόσο περιβαλλοντικοί όσο και γενετικοί παράγοντες. Έχει αποσαφηνισθεί ότι τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (CD4+) και ο σχηματισμός του τριμοριακού συμπλόκου μεταξύ Μείζονος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (MHC)-Πεπτιδίου Προσδέτη και Υποδοχέα Τ-κυττάρων (T-cell Receptor - TCR) διαδραματίζουν κυρίαρχο ρόλο κατά την εκδήλωση της ασθένειας. Μία από τις κύριες πρωτεΐνες της μυελινικής θήκης, η Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης (Myelin Basic Protein - MBP) θεωρείται ως πιθανό αυτοαντιγόνο γιατί προκαλεί Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - ΕΑΕ) όταν ενεθεί σε επίμυες Lewis. Στο πλαίσιο της αντιμετώπισης της ασθένειας έχει προταθεί ο σχεδιασμός και χρήση τροποποιημένων πεπτιδικών αναλόγων (Altered Peptide Ligands (APLs) του ανθρώπινου επίτοπου MBP87-99 ο οποίος αποσκοπεί στην παρεμπόδιση του σχηματισμού σταθερού συμπλόκου MHC-APL-TCR και κατ’ επέκταση των εγκεφαλιτογόνων Τ κυτάρων. Bιολογικά πειράματα έδειξαν ότι τα γραμμικά πεπτίδικά ανάλογα [Arg91,Ala96]MBP87-99 και [Ala91,96]MBP87-99, καθώς και τα κυκλικά πεπτίδια cyclo(87-99)[Arg91,Ala96]MBP87-99, cyclo(87-99)[Ala91,96]MBP87-99, και cyclo(91-99)[Ala96]MBP87-99 εμφανίζουν ανταγωνιστική δράση. Κατά την εκπόνηση της διατριβής πραγματοποιήθηκε διαμορφωτική ανάλυση των APLs σε μια προσπάθεια κατανόησης των φυσικοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών που απαιτούνται για ανταγωνιστική δράση. Για τη διαμορφωτική μελέτη ελήφθησαν φάσματα Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (ΝΜR) μίας και δύο διαστάσεων. Τα πειράματα NMR συνδυάσθηκαν με Μοριακή Δυναμική (Molecular Dynamics, MD) χρησιμοποιώντας τα λογισμικά ΜΟΕ και DYANA για να διευρευνηθούν οι χαμηλής ενέργειας ευνοϊκές διαμορφώσεις. Ανάμεσα σε αυτές αναζητήθηκαν και οι πιθανές βιοδραστικές, οι οποίες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως αρχικές για την πρόσδεση με τον υποδοχέα MHC-DRB1*1501 (pdb: 1ymm). Τα σύμπλοκα APL-MHC υποβλήθηκαν σε ΜΔ χρησιμοποιώντας το λογισμικό GROMACS. Η ίδια διαδικασία εφαρμόστηκε και στο σύμπλοκο MPB85-98 - MHC που απομονώθηκε από την κρυσταλλική δομή (pdb: 1ymm), ώστε να επιτευχθεί σύγκριση και εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με την αγωνιστική (πρόκληση ΕΑΕ) ή ανταγωνιστική (αναστολή ΕΑΕ) δράση των πεπτιδικών αναλόγων. Για το σκοπό αυτό διερευνήθηκε το δίκτυο των δεσμών υδρογόνου μεταξύ των ατόμων του πεπτιδικού σκελετού και του ενεργού κέντρου του υποδοχέα, οι υπόλοιπες μη δεσμικές αλληλεπιδράσεις , καθώς και η επιφάνεια επαφής των πεπτιδίων με το διαλύτη (solvent accessible surface area - SASA). Με βάση τα συμπεράσματα από τη μελέτη των συμπλόκων, καθορίστηκαν φαρμακοφόρες ομάδες και πραγματοποιήθηκε 3D αναζήτηση σε γνωστές βάσεις δεδομένων. Αναγνωρίστηκε ένα μόριο-οδηγός, το οποίο τροποποιήθηκε με ορθολογικό σχεδιασμό ώστε να εμφανίζει πιθανή ανταγωνιστική δράση.