Γονιδιακή θεραπεία μυοκαρδιοπαθειών: στοχεύοντας το οξειδωτικό στρες

Abstract

Recent studies support the contribution of oxidative stress in the development cardiovascular diseases. Oxidative stress has been strongly linked to cell death and cardiac remodeling processes, all hallmarks of heart failure. Mice null for desmin, which is the major muscle specific intermediate filament protein, develop dilated cardiomyopathy and heart failure characterized by mitochondrial defects and cardiomyocyte death accompanied by extensive calcification and fibrosis, thus providing a very good model for heart failure. Several cellular and biochemical alterations in the hearts of these mice strongly suggested that oxidative stress is one of mechanisms contributing to the pathogenesis of the phenotype. The defects in mitochondrial structure and function, hallmarks of the desmin null mouse phenotype, provide the most important indications for the existence of oxidative stress, as the respiratory chain is the most important source of reactive oxygen species (ROS) in cardiomyocytes. In order to delineate the existence of oxidative stress in the desmin null myocardium and therefore its participation in the development of the myocardial degeneration we sought both in vitro and in vivo approaches. The existence of oxidative stress was addressed in primary adult cardiomyocytes. The reinforcement of antioxidant defense system was pursued, in order to assess the contribution of oxidative stress in the myocardial degeneration, as well as the therapeutic potential of antioxidant strategies. To assess intracellular oxidative stress a new method for the isolation of adult mouse cardiomyocytes was developed. Since mitochondria were the target of pathology, we wanted to first determine global changes in the mitochondrial proteome. The observed changes in protein levels reinforced the original hypothesis. Intracellular reactive oxygen species were measured using fluorescent probes in adult cardiomyocyte cultures. Analysis of the above data showed that there are increased levels of ROS in desmin null cardiomyocytes. Furthermore, the mitochondrial membrane potential, which is indicative of proper mitochondrial function, was investigated using a fluorescent probe. It was found altered in a subset of the desmin null cardiomyocytes. In order to (1) verify the existence of oxidative stress in vivo, (2) assess its contribution to the phenotype of desmin null mice and (3) evaluate the therapeutic 5 potential of protecting against it, the antioxidant defense system was fortified in vivo using the desmin null mouse as a heart failure model. Towards this goal transgenic mice overexpressing the antioxidant genes catalase and manganese superoxide dismutase (MnSOD) were created.

Πρόσφατες µελέτες παρέχουν ενδείξεις για τη συµµετοχή του οξειδωτικού στρες στην ανάπτυξη καρδιαγγειακών νοσηµάτων. Το οξειδωτικό στρες έχει συσχετιστεί ισχυρά µε τον κυτταρικό θάνατο και διαδικασίες καρδιακής αναδόµησης, αποτελούν χαρακτηριστικά της καρδιακής ανεπάρκειας. Μύες χωρίς δεσµίνη, αντική πρωτεΐνη των µυϊκών ενδιαµέσων ινιδίων, αναπτύσσουν διατατική υοκαρδιοπάθεια και καρδιακή ανεπάρκεια, η οποία χαρακτηρίζεται από ιτοχονδριακές ανωµαλίες και κυτταρικό θάνατο µαζί µε εκτεταµένες εναποθέσεις ασβεστίου και ίνωση, προσφέροντας έτσι ένα πολύ καλό µοντέλο καρδιακής ανεπάρκειας. #ιάφορες κυτταρικές και βιοχηµικές αλλοιώσεις στην καρδιά των µυών αυτών υποδηλώνουν έντονα ότι το οξειδωτικό στρες είναι ένας σηµαντικός ηχανισµός που συµβάλλει στην παθογένεση αυτού του φαινότυπου. Οι ανωµαλίες µιτοχονδριακή δοµή και λειτουργία, οι οποίες χαρακτηρίζουν το φαινότυπο του χωρίς δεσµίνη, προσφέρουν τις πιο σηµαντικές ενδείξεις για την ύπαρξη οξειδωτικού στρες, καθώς η αναπνευστική αλυσίδα είναι η πιο σηµαντική πηγή ραστικών Ενώσεων Οξυγόνου (#ΕΟ ή Reactive Oxygen Species - ROS) στα υοκαρδιοκύτταρα. Προκειµένου να διασαφηνιστεί η ύπαρξη οξειδωτικού στρες στο µυοκάρδιο απουσία δεσµίνης και συνεπώς η συµµετοχή του στην εξέλιξη του µυοεκφυλισµού, επιχειρήθηκαν τόσο in vitro, όσο και in vivo προσεγγίσεις. Η ύπαρξη οξειδωτικής καταπόνησης διερευνήθηκε σε πρωτογενείς καλλιέργειες ενήλικων υοκαρδιοκυττάρων. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η ενίσχυση του αντιοξειδωτικού υντικού συστήµατος, έτσι ώστε να αποτιµηθεί, τόσο η συµβολή του οξειδωτικού στρες στο µυοεκφυλισµό, όσο και η πιθανή θεραπευτική δράση των αντιοξειδωτικών στρατηγικών. Προκειµένου να αποτιµηθούν τα επίπεδα ενδοκυτταρικής οξειδωτικής καταπόνησης αναπτύχθηκε µία νέα µέθοδος αποµόνωσης ενήλικων 1 µυοκαρδιοκυττάρων από µυ. Επειδή τα µιτοχόνδρια αποτελούν το κύριο στόχο των παρατηρούµενων αλλοιώσεων, επιχειρήθηκε πρώτα ο προσδιορισµός των γενικών αλλαγών που παρατηρούνται στο µιτοχονδριακό πρωτέωµα. Πράγµατι, οι παρατηρούµενες αλλαγές στα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης ενίσχυσαν την αρχική υπόθεση. Στη συνέχεια εκτιµήθηκαν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε καλλιέργειες ενήλικων µυοκαρδιοκυττάρων χρησιµοποιώντας φθορίζοντες ιχνηθέτες. Ανάλυση των αποτελεσµάτων έδειξε ότι υπάρχουν αυξηµένα επίπεδα ROS στα µυοκαρδιοκύτταρα απουσία δεσµίνης. Επιπλέον, διερευνήθηκε το µιτοχονδριακό µεµβρανικό δυναµικό, το οποίο είναι ενδεικτικό της σωστής µιτοχονδριακής λειτουργίας, χρησιµοποιώντας ειδικό φθορίζοντα ιχνηθέτη. #ιαπιστώθηκε ότι υπάρχουν σηµαντικές αλλοιώσεις σε αρκετά µυοκαρδιοκύτταρα απουσία δεσµίνης.