Ανασυνδυασμένα στελέχη πολιοϊών - θέσεις γενετικού ανασυνδυασμού

Abstract

This thesis describes the analysis of recombinant poliovirus strains obtained from clinical and environmental samples. Five polio/Sabin recombinant strains isolated from healthy vaccinees or from VAPP patients after OPV administration, were analysed. RT-PCR, followed by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) screening analysis was applied in four distant genomic regions (5' UTR, VP1, 2C and 3C-3D) in order to detect any putative recombinant. The detected recombinants were sequenced from 2C to the end of the genome (3' UTR) and the exact recombination sites were determined with computational analysis. Two of the recombinants were found in the 2C genomic region, isolates EP16:S3/S2, EP23:S3/S1, two in 3D genomic region isolates EP6:S2/S1, EP12:S2/S1 and one in 3A genomic region isolate EP9:S2/Sl. Point mutations were found in strains EP3, EP6, EP9 and EP12. Five more clinical Sabin intertypic recombinant strains were investigated. Strains EPA, EPB and EPC were found to be bi-recombinant Sabin3/Sabin2/Sabin3 (S3/S2/S3), one strain was characterized as a probable S3/S2- CAV18 or CAV21-S2/S1 multi-recombinant (EDP11) and one was identified as a tripartite one S3/S2/S1 (EDP12). Samples EPA, EPB and EPC presented a common recombination junction in the 2C genomic region. Moreover, strains EPA and EPB shared also the second recombination site in the 3D genomic region, whereas the second recombination of EPC was also determined in 3D but in a different nucleotide position. Strains EDP11 and EDP12 presented both identical recombination motifs and recombination sites. The first was detected in the 2C genomic region and the second in the 3D region. Strain EDP11 presented an interesting feature since a sequence of 120 nucleotides seems to have derived from a member of human enteroviruses species C (CAV18 or CAV21). This finding is of great importance, considering that this strain (EDP11) was isolated from an area and time period, where no Coxsackie A virus or poliovirus epidemics occurred.

Στη παρούσα διατριβή αναλύονται ανασυνδυασμένα στελέχη πολιοϊών τα οποία απομονώθηκαν από κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα. Αρχικά αναζητήθηκαν οι πιθανές θέσεις ανασυνδυασμών στο γένωμα των πολιοϊών καλύπτοντας την γενωμική περιοχή από τη 2C έως τη 3D με σκοπό τον εντοπισμό όλων των πιθανών σημείων ανασυνδυασμού. Πέντε κλινικά στελέχη προερχόμενα από υγιείς εμβολιασμένους και ασθενείς με VAPP εξετάσθηκαν για τον εντοπισμό θέσεων ανασυνδυασμού. Κατόπιν ανάλυσης RT-PCR,RFLP και αλληλούχισης , σε τρεις γενωμικές περιοχές (5’UTR, 2C και 3C-D) τα πέντε δείγματα εμφάνισαν θέσεις ανασυνδυασμού. Τα ανασυνδυασμένα δείγματα στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν από τη 2C έως τη 3’UTR. Τα στελέχη ΕΡ6 και ΕΡ12 παρουσίασαν τον τύπο ανασυνδυασμού S2/S1 στη 3D γενωμική περιοχή, ενώ τα στελέχη ΕΡ16 και ΕΡ23 τους τύπους S3/S2 και S3/S1 αντίστοιχα στη 2C περιοχή. Το στέλεχος ΕΡ9 βρέθηκε ανασυνδυασμένο στη 3Α περιοχή ως S2/S1, γενωμική περιοχή όπου οι ανασυνδυασμοί σπανίζουν. Άξιο λόγου είναι το γεγονός πως οι θέσεις των ανασυνδυασμών στα στελέχη ΕΡ12 και ΕΡ16 είναι όμοιες με αυτές που βρέθηκαν σε προηγούμενη μελέτη. Επίσης παρατηρήθηκαν σημειακές μεταλλαγές στα ανασυνδυασμένα δείγματα EΡ6,ΕΡ9 και EP12. Πέντε στελέχη Sabin εμφάνισαν ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς ευρέθηκαν διπλά ανασυνδυασμένα. Ανάλυθηκαν και πάλι με RT-PCR,RFLP και αλληλούχιση. Τα πέντε δείγματα εμφάνισαν δύο θέσεις ανασυνδυασμού? η πρώτη στη 2C περιοχή και η δεύτερη στη 3D. Στα δείγματα ΕΡΑ, ΕΡΒ και EPC το 5’ τμήμα του γονιδιώματος ήταν Sabin τύπου 3, το ενδιάμεσο Sabin τύπου 2 και το τμήμα 3’ Sabin τύπου 3 (S3/S2/S3). Ο πρώτος ανασυνδυασμός και για τα τρία στελέχη βρισκόταν στη 2C περιοχή και ο δεύτερος ήταν επίσης και για τα τρία στελέχη στη 3C-D περιοχή. Για τα στελέχη EDP11 και EDP12 το 5’ τμήμα του γονιδιώματος ήταν Sabin τύπου 3, το ενδιάμεσο τμήμα τύπου 2 και το 3΄ τμήμα τύπου 1 (S3/S2/S1),τα μοτίβα και οι θέσεις των ανασυνδυασμών ήταν κοινά. Όσον αφορά το στέλεχος EDP11 αυτό παρουσίασε ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό, μία αλληλουχία 120 περίπου νουκλεοτιδίων η οποία φαίνεται να προκύπτει από μέλος της ομάδας των εντεροϊών C (CAV18 ή CAV21). Το εύρημα αυτό είναι σημαντικό, καθώς το στέλεχος EDP11 απομονώθηκε από περιοχή που τη δεδομένη χρονική περίοδο, καμία επιδημία από ιούς Coaxsackie A ή πολιοϊούς δε συνέβαινε.