Διερεύνηση της σταθερότητας λιπιδικών μικροσφαιριδίων ως φορέων ανοσολογικών παραγόντων

Abstract

Certain amphiphilic water-soluble polymers including amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone (PVP) were found to be efficient steric protectors for liposomes in vivo. In this study, we have tried to develop synthetic pathways for amphiphilic PVP and investigate the influence of the hydrophilic/hydrophobic blocks on the properties of resulting polymers and polymer-coated liposomes. ESR-spectra with the Doxyl spin-probe, in the presence of amphiphilic PVP demonstrated good accessibility of terminal stearyl-groups for the interaction with other hydrophobic ligands. Stearyl-PVP forms stable micelles and it was found that amphiphilic PVP with Mw between 1500 and 8000 provides good steric protection for liposomes. We have investigated on the basis of different amphiphilic water-soluble derivatives of PVP the properties of new nanoscaled polymeric carriers. The polymer self-assembly and interaction with model proteins (Bowman-Birk soybean proteinase inhibitor (BBI) and its hydrophobized derivatives) were studied in aqueous media. The possibility of inclusion of both BBI and hydrophobized oleic acid derivatives of BBI in amphiphilic PVP aggregates was explored. We have also investigated biophysical parameters of liposome constructs with embedded lipopeptides from the principle neutralizing domain of the V3-loop of the HIV-1 gp120 and their influence on viral infectivity. The V3-loop alters host cell immune function and modulates infectivity. Dynamic light scattering measurements showed liposome supramolecular structures with hydrodynamic radius of the order of 900 and 1300 nm for plain and V3-lipopeptide liposomes. Electron paramagnetic resonance measurements showed almost identical local microenvironment. The difference in liposome hydrodynamic radius was attributed to the fluctuating ionic environment of the V3-lipopeptide liposomes. In vitro HIV-1 infectivity assays showed that plain liposomes reduced virus production in all cell cultures, probably due to the hydrophobic nature of the aggregates. Liposomes carrying V3-lipopeptides with different cationic potentials restored and even enhanced infectivity. These results highlight the need for elucidation of the involvement of lipid bilayers as dynamic components in supramolecular structures and in HIV-1 fusion mechanisms.

Το ανοσοποιητικό σύστημα του ανθρώπου είναι στις μέρες μας στόχος πολλών ερευνητικών προσπαθειών ως μέσο καταπολέμησης κυρίως ενδογενών ασθενειών. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι επιτρέπει την ΄΄εκπαίδευση΄΄ ειδικών κυτταρικών πληθυσμών, τα οποία αποκτούν την ικανότητα να αναγνωρίζουν και να καταστρέφουν τον επιθυμητό στόχο, ο οποίος καλείται αντιγόνο. Τα αντιγόνα είναι τις περισσότερες φορές μακρομόρια, όπως οι πρωτεΐνες, οι οποίες ενώ στην επιφάνεια του κύτταρου είναι βιολογικά και δομικά σταθερές, συνήθως χαρακτηρίζονται από αστάθεια όταν βρίσκονται σε διάλυμα. Οι θεραπευτικές εφαρμογές βιοδραστικών πρωτεϊνών απέκτησαν ενδιαφέρον τη τελευταία δεκαετία. Όμως οι κλινικές εφαρμογές των περισσότερων από αυτές τις πρωτεΐνες περιορίζονται εξ αιτίας της χαμηλής θεραπευτικής αποτελεσματικότητας. Αυτό συμβαίνει διότι οι πρωτεΐνες αποσυντίθενται άμεσα in vivo από διάφορες πρωτεάσες και απομακρύνονται ταχύτατα από την κυκλοφορία του αίματος. Στη διατριβή αυτή συνθέσαμε αμφιφιλικά πολυμερή, με σκοπό να αποτελέσουν μεταφορείς χημικών ουσιών και επιπλέον να είναι ικανά να τροποποιήσουν την επιφάνεια λιποσωματίων, με στόχο την αύξηση της σταθερότητάς τους κατά την αποικοδόμηση από τα κύτταρα. Η χρήση των αμφιφιλικών πολυμερών για τους παραπάνω σκοπούς διερευνάται με πολυμερή του μορίου της πολυβινυλοπυρρολιδόνης (PVP), τα οποία έχουν ήδη επιτραπεί για χρήση στην ιατρική ως εναίσιμα σκευάσματα. Στόχος μας ήταν η διερεύνηση της δυναμικής συμπεριφοράς των πολυμερών της πολυβινυλοπυρρολιδόνης (με ή χωρίς υδρόφοβες ομάδες), καθώς επίσης και η συσχέτιση του προσδιορισμού των μεγεθών των συστημάτων αυτών με αποτελέσματα προηγούμενων μελετών. Ακόμη, πραγματοποιήθηκε σύνθεση λιποσωματίων και V3 επικαλυμμένων λιποσωματίων, ώστε να διαπιστωθεί κατά πόσο τα μακρομόρια αυτά επηρεάζουν την μολυσματικότητα του ιού του AIDS. Η μελέτη των συγκεκριμένων μακρομορίων σε μοριακό επίπεδο πραγματοποιήθηκε με τεχνικές σκέδασης ακτινών Laser (Laser Light Scattering, LS) αλλά και μέσω της τεχνικής φασματοσκοπίας ηλεκτρονικού παραμαγνητικού συντονισμού (Electron Paramagnetic Resonance) με χρήση spin-probes νιτροξειδίων. Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα εργαλεία για τη διερεύνηση της δομής αλλά και της δυναμικής βιοϋλικών. Η μελέτη των αλληλεπιδράσεων μορίου-μορίου στο φυσικό υδατικό τους περιβάλλον με τεχνικές σκέδασης ακτινών Laser αποτελεί μια πολύ σημαντική ερευνητική δραστηριότητα τα τελευταία χρόνια. H δυναμική σκέδαση ακτινών Laser (Dynamic Light Scattering, DLS) είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στο να ανιχνεύει την παρουσία ακόμη και πολύ μικρών συγκεντρώσεων συσσωματωμάτων βιομορίων (<0.01 % w/w). Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός με τεχνικές σκέδασης ακτινών Laser συνεισφέρει στην εξαγωγή συμπερασμάτων, τόσο για το μέγεθος και τη δομή τους στο φυσικό τους υδατικό περιβάλλον, όσο και σχετικά με την παρακολούθηση της αλλαγής της διαμόρφωσης καθώς και του μεγέθους των βιομορίων σαν συνάρτηση του χρόνου. Η χρονική κλίμακα των τοπικών και μακρομοριακών κινήσεων που παρατηρούνται μέσω της Φασματοσκοπίας Συσχετισμού Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) είναι αρκετά ευρεία (10-7-103 s) και επιτρέπει τον προσδιορισμό των διαστάσεων και της διαμόρφωσης συνθετικών και βιολογικών μακρομορίων, και γενικότερα μορίων ιδιαίτερα σημαντικών για την ιατρική.