Μεταβολή κυτταροκινών και πρωτεολυτικών ενζύμων κατά την εξέλιξη της οξείας ιογενούς ηπατίτιδας

Abstract

ΣΚΟΠΟΣ. Βαρύνουσα σημασία στην καταστροφή του ηπατοκυττάρου κατά την διάρκεια οξείας ιογενούς ηπατίτιδος έχει δοθεί στην κυτταρική ανοσία, ενώ άλλοι µηχανισµοί ηπατοκυτταρικής καταστροφής δεν έχουν επακριβώς µελετηθεί. Σκοπός της παρούσης µελέτης αποτελεί η ανίχνευση νέων επιπρόσθετων µοντέλων καταστροφής του ηπατοκυττάρου, διαµέσου παραγωγής χυµικών παραγόντων, κατά την διάρκεια οξείας ιογενούς ηπατίτιδος. Η υπόθεση που θα ελεγχθεί βασίζεται στο γεγονός ότι αντιγόνα των ιών της ηπατίτιδος Α, Β, και C παρουσιαζόµενα από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (κυρίως κύτταρα Kupffer) στα Τ CD4+ λεµφοκύτταρα προκαλούν την παραγωγή μιας σειράς κυτταροκινών που οδηγούν στην ενεργοποίηση της πρωτογενούς και επίκτητης ανοσιακής απάντησης. Μελετήσαµε τα τρία σκέλη της ανοσολογικής απάντησης διαµέσου της µέτρησης στον ορό των κυτταροκινών που συνδέονται µε αυτές καθώς και ορισµένων από τους χυµικούς παράγοντες που θεωρούµε ότι µετέχουν στις φλεγµονώδεις διεργασίες. Αναλυτικότερα: Πρωτογενή ανοσολογική απάντηση: Κυτταροκίνες (IL-1, IL6, TNF-α) , πρωτείνες οξείας φάσεως (CRP, C3, σερουλοπλασµίνη CER, α1 αντιθρυψίνη AAT, απτοσφαιρίνη HAP), αναστολείς των πρωτεολυτικών ενζύµων (ΑΑΤ, α2 µακροσφαιρίνη AMG), Τύπου 1 ανοσολογική απάντηση: Κυτταροκίνες (IL-2, IL12, IFN- γ) Τύπου 2 ανοσολογική απάντηση: Κυτταροκίνες (IL-4, IL10), κυκλοφορούντα ανοσοσυµπλέγµατα. Μονοξείδιο του αζώτου (NO) και TGF-β Μεταλλοπρωτεάσες και ιστικοί αναστολείς αυτών. ΑΣΘΕΝΕΙΣ. Από το 1995-1997 19 ασθενείς µε οξεία ιογενή ηπατίτιδα συµπεριελήφθησαν στην µελέτη (12 άνδρες, 7 γυναίκες) µέσης ηλικίας 29.95 ετών (από 16-65 ετών). 2 ασθενείς µε οξεία ηπατίτιδα A, 2 ασθενείς µε οξεία ηπατίτιδα C και 15 ασθενείς µε οξεία ηπατίτιδα B. Αιµοληψία εγένετο κατά την πρώτη και τρίτη ηµέρα της εισόδου των ασθενών στην Γαστρεντερολογική Κλινική, το πρωί στις 8 π.µ. και το απόγευμα στις 6 µ.µ. Ακολούθησαν οι µετρήσεις στον ορό των ασθενών και σε κατεψυγμένο ορό 15 αιμοδοτών (8 άνδρες), ηλικίας από 18-45 ετών. ΜΕΘΟ∆ΟΣ. Οι μετρήσεις των κυτταροκινών έγιναν µε εµπορικώς διαθέσιµη ELISA. Οι µετρήσεις των πρωτεϊνών οξείας φάσεως έγιναν µε νεφελοµετρία. Τα ανοσοσυµπλέγµατα µετρήθηκαν επίσης µε εµπορικώς διαθέσιµα αντιδραστήρια σε νεφελόµετρο. Οι µετρήσεις των µεταλλοπρωτεασών έγιναν µε δύο µεθόδους Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), και Gelatin zymography. Για τον προσδιορισµό της συστηµατικής παραγωγής του ΝΟ, µετρήθηκε η συγκέντρωση στον ορό των δειγµάτων των ολικών νιτρικών (nitrite, NO2-) και νιτρωδών (nitrate, NO3-). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ. ∆εν ανιχνεύθηκε ηµερήσια διακύµανση ή διαφορές ανάµεσα στην πρώτη και Τρίτη ηµέρα νοσηλείας στις συγκεντρώσεις του ορού των κυτταροκινών, πρωτεινών οξείας φάσεως, µεταλλοπρωτεασών και αναστολέων, ΝΟ και ανοσοσυµπλεγµάτων. Έτσι αναλύθηκε η µέση τιµή για τον κάθε ασθενή. Κυτταροκίνες της επίκτητης ανοσίας: Οι τιµές στον ορό του TNF-α, IL-6 IL1-β βρέθηκαν στατιστικά σηµαντικά αυξηµένες στους ασθενείς σε σχέση µε την οµάδα ελέγχου (p<0.001, p<0.05 και p<0.01 αντίστοιχα). Th1 κυτταροκίνες: Η IL-2 βρέθηκε στατιστικά σηµαντικά µειωµένη στους ασθενείς σε σχέση µε την οµάδα ελέγχου, (p<0.0001). Οι τιµές της IL-12 και της IFN-γ βρέθηκαν σηµαντικά υψηλότερες στους ασθενείς από την οµάδα ελέγχου (p<0.05 και p<0.0001 αντίστοιχα). Th2 κυτταροκίνες: Οι ασθενείς βρέθηκαν να έχουν υψηλότερες IL- 4 και IL-10 τιµές σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (p<0.001 και p<0.001 αντίστοιχα). TGF-β: Τα επίπεδα στον ορό του TGF-β στους ασθενείς βρέθηκαν αυξηµένα σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (P<0.05). Πρωτεΐνες οξείας φάσεως: Οι τιµές των CRP, AAT και C3 ήταν σηµαντικά αυξηµένες στους ασθενείς σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (p<0.001, p<0.001, και p<0.01). Οι τιµές της CER βρέθηκαν αυξηµένες αλλά χωρίς σηµαντική διαφορά. Σε αντίθεση η HAP βρέθηκε σηµαντικά µειωµένη στους ασθενείς σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (p<0.001). Ανοσοσυµπλέγµατα (CIC):Τα CIC στους ασθενείς είχαν µέση τιµή µεγαλύτερη στους ασθενείς από την οµάδα ελέγχου (p<0.001). Η θετική συσχέτιση των CIC µε τον παράγοντα του συµπληρώµατος C3 πιθανόν εν µέρει να εξηγεί την απουσία επιπλοκής από νόσο ανοσοσυµπλεγµάτων µια που η σύνδεση τους µε το συµπλήρωµα τα διατηρεί διαλυτά. Μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ):Τα επίπεδα στον ορό των νιτρικών (nitrites NO2- ) και νιτρωδών (nitrates NO3- ) βρέθηκαν υψηλότερα στους ασθενείς σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (p<0.001). MMPs: Η µέση τιµή συγκέντρωσης στον ορό όλων των MMPs ήταν µειωµένη σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (MMP-1 P<0,05, MMP-3 P<0,05, MMP- 2 P<0,001, και η MMP-9 P<0,05). TIMPs: ∆εν υπήρχε διαφορά στην συγκέντρωση του TIMP-1 ανάµεσα στους ασθενείς και τους υγιείς µάρτυρες. (P=0,984). Αντιθέτως η τιµή του TIMP-2 και της ήταν στατιστικά αυξηµένη στους ασθενείς έναντι των υγιών µαρτύρων (P<0,001). Και στην Zymography οι δύο γελατινάσες MMP-2 και MMP-9 έδειξαν µειωµένες τιµές στους ασθενείς από την οµάδα ελέγχου (και στις δύο περιπτώσεις P<0,001). AMG: Η AMG βρέθηκε αυξηµένη στους ασθενείς σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου (P <0.001). Στους ασθενείς δεν βρέθηκε συσχέτιση µεταξύ ΜMP-1, MMP-3, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 ELISAs, MMP-2, MMP-9 Zymography και στα επίπεδα των τρανσαµινασών. Η αρνητική συσχέτιση της AMG µε τις τρανσαµινάσες που παρατηρήθηκε οδηγεί στην υπόθεση ότι πιθανόν όσο αυξάνεται η AMG και κατά συνέπεια αναστέλλονται οι MMPs (όντως µία σηµαντική αρνητική συσχέτιση βρέθηκε µεταξύ της ΑMG και της MMP-1), τόσο µειώνεται η ηπατοκυτταρική καταστροφή. Η θετική συσχέτιση µεταξύ των δύο αυξηµένων αναστολέων AMG και TIMP-2 θέτουν υπόνοια κοινού ελέγχου παραγωγής των δύο αυτών αναστολέων την συγκεκριµένη χρονική στιγµή κάτι που δεν συµβαίνει µε τον TIMP-1. Τα επίπεδα του τελευταίου παρά το ότι δεν βρέθηκαν αυξηµένα εντούτοις παρουσιάζουν θετική συσχέτιση µε τις MMP-9, Z-MMP-9 και την Z-MMP-2. Εξ’ άλλου οι τρεις αυτές MMPs είναι και οι µόνες από τις MMPs που σχετίζονται θετικά µεταξύ τους. Ανάλυση των συγκεντρώσεων MMPs και TIMPs σε σχέση µε τον ιό ή την έκβαση της νόσου δεν έδειξε σηµαντικές συσχετίσεις. Συγκρίνοντας τα αποτελέσµατα της υποοµάδας των 15 ασθενών µε οξεία ηπατίτιδα Β µε την οµάδα ελέγχου δεν βρέθηκαν περαιτέρω διαφορές. Επίσης αναλύθηκαν τα αποτελέσµατα των 16 ασθενών που παρουσίασαν ίαση (14 ασθενείς µε ηπατίτιδα B και 2 ασθενείς µε ηπατίτιδα A) και συγκρίθηκαν µε τους 2 ασθενείς µε ηπατίτιδα C και τον 1 ασθενή µε ηπατίτιδα B που ανέπτυξαν χρονιότητα. Παρά το ότι εξ’ αιτίας του µικρού αριθµού και της ετερογένειας της δεύτερης οµάδας δεν µπορούν να στηριχθούν κατηγορηµατικά συµπεράσµατα, παρατηρήθηκε µία σηµαντικά αυξηµένη µέση τιµή της AAT (p<0.05) στην οµάδα αυτή σε σχέση µε την πρώτη οµάδα των ιαθέντων ασθενών. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Στο ικτερικό στάδιο της αυτοπεριοριζόµενης οξείας ηπατίτιδας: Οποιεσδήποτε διακυµάνσεις της ανοσολογικής απάντησης κατά την διάρκεια οξείας µη-επιπλεγµένης ιογενούς ηπατίτιδας επισυµβαίνουν σε χρονικό διάστηµα µεγαλύτερο από 3 ηµέρες, ενώ ούτε ηµερήσια διακύµανση παρατηρείται. Το προφίλ της ανοσολογικής απάντησης των ασθενών µας µε την µικρή αύξηση των προφλεγµονωδών και την επικράτηση των αντιφλεγµονωδών κυτταροκινών αντανακλά την ήπια πορεία της νόσου και την τελική της έκβαση. Χημικοί παράγοντες κυρίως της αρχέγονης ανοσολογικής απάντησης όπως οι κυτταροκίνες, οι πρωτεΐνες οξείας φάσεως, το µονοξείδιο του αζώτου, οι µεταλλοπρωτεάσες και οι αναστολείς τους συµµετέχουν ενεργά στο στάδιο αυτό της νόσου. Η αυξηµένη τιµή των αναστολέων των µεταλλοπρωτεασών έχει να κάνει µε την αδρανοποίηση των µεταλλοπρωτεασών και την διακοπή της επεξεργασίας της εξωκυτταρίου θεµελίου ουσίας µετά τον έλεγχο της ιικής λοιµώξεως. Η ανίχνευση µιας επικρατούσης ανοσολογικής απάντησης τύπου 2 στο στάδιο αυτό δεν σημαίνει απαραίτητα χρονιότητα. Η χρησιµότητα της ΑΑΤ ως προγνωστικού δείκτη επερχόμενης χρονιότητας και ο ρόλος του µονοξειδίου του αζώτου στον καθορισµό της ανοσολογικής απάντησης χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.