Μελέτη των μηχανισμών μετανάστευσης κυττάρων στο προπαρεγκεφαλιδικό σύστημα

Abstract

In the developing nervous system neurons need to migrate often long distances to reach their final position and form the appropriate synaptic contacts. The migration of neurons takes place in two directions: radially and tangentially. In the region of the developing rhombencephalon many tangential migratory streams are observed. In this study we focused on two populations of neurons generated in the rhombic lip of rhombomeres 7 and 8 which migrate ventrally following two different migratory steams. The neurons of the caudal superficial migratory stream migrate just beneath the pial surface, cross the ventral midline and form the lateral reticular (LRN) and the external cuneate nucleus (ECN) at the contralateral side of their origin. The cells of the olivary stream migrate deep in the parenchyma and stop ipsilaterally against the floor plate to form the inferior olive nucleus (ION). First, in this study we use an in vitro assay for the culture of the region where these migrations take place and we analyze the morphology of the migrating cells of the superficial stream. We show evidence that these cells are preceded by long leading processes and during their migration they follow two different migratory patterns. At the beginning of their migration in the dorsal neural tube, they migrate in close apposition to each other and form distinct chains, whereas they disperse and follow Tuj-1 immunoreactive axons on reaching the ventral hindbrain. This suggests that, in the superficial stream, neuronal migration combines both homotypic and heterotypic mechanisms. We also show that the adhesion molecule TAG-1 is expressed by the migrating cells only during the period of migration. Blocking TAG-1 function results in alterations in the superficial migration, indicating that TAG-1 is involved in the superficial migration. Moreover, in TAG-1-deficient animals we observed fewer migrating cells at the superficial stream. Other members of the immunoglobulin superfamily and known ligands of TAG-1 are also expressed in the region of the migration but are not involved in the migration. These findings provide evidence that the TAG-1 protein is involved as a contact-dependent signal guiding not only axonal outgrowth but also cell migration probably via a homophilic type of interaction. The cells of the olivary migratory stream express the transcription factor Brn3.2 during their migration and after they settle to their final position. In this study, by using chick-quail chimeras, we provide evidence that not only the intrinsic fate of the migrating cells but also the environment of the migration is important for the formation of the appropriate nuclei. Moreover, we show that the floor plate exhibites a strong chemoattractive influence on both migratory streams that deviate from their normal path and follow the direction of ectopic floor plate fragments. In addition, the floor plate produces a short-range stop signal to the olivary cells which aggregate at both sides of this region. Ectopic sources of netrin can mimic the effect of the floor plate in the cell of the superficial migratory stream, which express the DCC netrin receptor during their migration. In contrast, the olivary cells express the DCC receptor when they are located near the rhombic lip and when they reach the midline, so ectopic netrin sources attract the olivary cells only when they are at the dorsal neural tube. In addition, we show evidence that the stop signal provided by the floor plate to the migrating olivary cells is probably the interaction between ephrin-B3, expressed by the floor plate, and EphA4, which is expressed by the migrating cells. In EphA4- deficient mice some cells of the inferior olive nucleus do not stopped before the floor plate and they are detected on the midline. In general, our findings provide evidence that both contact-dependent signals and chemoattractive cues influence the migration of the cells of the superficial migratory and olivary steams in the caudal medulla. Moreover, in this study we provide another example of common cues involved in both axonal guidance and cell migrations.

Κατά την ανάπτυξη του νευρικού συστήµατος των σπονδυλωτών τα πρόδροµα νευρικά κύτταρα χρειάζεται να µεταναστεύσουν, πολλές φορές διανύοντας µεγάλες αποστάσεις, ώσπου να φτάσουν στις τελικές τους θέσεις και να δηµιουργήσουν τις απαραίτητες συνάψεις. Η µετανάστευση των νευρώνων µπορεί να γίνει είτε ακτινωτά είτε οριζόντια. Στην περιοχή του αναπτυσσόµενου ροµβοειδούς εγκεφάλου παρατηρούνται αρκετά οριζόντια µεταναστευτικά µονοπάτια. Στη συγκεκριµένη εργασία εστιαστήκαµε σε δύο πληθυσµούς νευρώνων που δηµιουργούνται στην περιοχή του ροµβικού χείλους των ροµβοµερών 7 και 8 και µεταναστεύουν κοιλιακά, ακολουθώντας δύο διαφορετικά µεταναστευτικά µονοπάτια. Τα κύτταρα του οπίσθιου επιφανειακού µεταναστευτικού µονοπατιού (ΟΕΜΜ) µεταναστεύουν ακριβώς κάτω από την εξωτερική (pial) επιφάνεια, διασχίζουν τη µέση γραµµή και δηµιουργούν τον πλάγιο δικτυωτό (Π∆Π) και τον έξω σφηνοειδή πυρήνα (ΕΣΠ) ετερόπλευρα από το σηµείο που ξεκίνησαν. Τα κύτταρα του µεταναστευτικού µονοπατιού της κάτω ελαίας (ΜΜΚΕ) µεταναστεύουν βαθιά στο παρέγχυµα και σταµατούν οµόπλευρα, εκατέρωθεν του εδαφιαίου πετάλου σχηµατίζοντας τους πυρήνες της κάτω ελαίας ΠΚΕ). Στη παρούσα µελέτη χρησιµοποιήσαµε ένα σύστηµα in vitro καλλιέργειας και αναλύσαµε τη µορφολογία των κυττάρων του ΟΕΜΜ. ∆είξαµε ότι τα κύτταρα του συγκεκριµένου µονοπατιού εκτείνουν µεγάλες καθοδηγητικές αποφύσεις και ακολουθούν δύο διαφορετικά πρότυπα µετανάστευσης. Στην αρχή της µεταναστευτικής τους πορείας και όταν βρίσκονται ακόµα στη ραχιαία πλευρά του νευρικού σωλήνα, µεταναστεύουν σε στενή επαφή το ένα µε το άλλο σχηµατίζοντας αλυσίδες. Αντίθετα, όταν τα κύτταρα φτάνουν στην κοιλιακή πλευρά του νευρικού σωλήνα ακολουθούν προϋπάρχοντες Tuj-1 θετικούς άξονες ως φορείς στήριξης. Το γεγονός αυτό δείχνει ότι στο ΟΕΜΜ συνυπάρχουν οµοτυπικοί και ετεροτυπικοί µηχανισµοί αλληλεπίδρασης. ∆είξαµε επίσης ότι το µόριο συνάφειας TAG-1 εκφράζεται από τα κύτταρα του ΟΕΜΜ µόνο κατά τη διάρκεια της µετανάστευσής τους. Αναστέλλοντας τη δράση του συγκεκριμένου µορίου, προκαλούνται προβλήµατα στη µετανάστευση των κυττάρων του ΟΕΜΜ, γεγονός που φανερώνει ότι η TAG-1 εµπλέκεται στη διαδικασία της µετανάστευσης. Επιπλέον, στα ζώα που εµφανίζουν απώλεια δράσης του γονιδίου της TAG-1 παρατηρούνται λιγότερα κύτταρα στο ΟΕΜΜ. Άλλα µέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών και γνωστοί προσδέτες της TAG-1, που εκφράζονται στην περιοχή του ΟΕΜΜ, δεν φαίνεται να εµπλέκονται στη διαδικασία της µετανάστευσης. Αυτά τα αποτελέσµατα δείχνουν ότι η TAG-1 δρα ως ένα εξ’ επαφής καθοδηγητικό σήµα, που εµπλέκεται όχι µόνο στην επέκταση νευραξόνων, αλλά και στην καθοδήγηση κυτταρικών σωµάτων, πιθανότατα µέσω ενός οµοφιλικού τύπου σύνδεσης. Τα κύτταρα του ΜΜΚΕ εκφράζουν το µεταγραφικό παράγοντα Brn3.2 τόσο κατά τη διάρκεια της µετανάστευσής τους όσο και µετά την τοποθέτησή τους στις τελικές τους θέσεις. Με τη χρήση χιµαιρικών ιστοτεµαχίων όρνιθας-ορτυκίου, δείξαµε ότι τόσο η εσωτερική µοίρα των κυττάρων, όσο και το περιβάλλον, στο οποίο συντελείται η µετανάστευση, επηρεάζουν την τελική δηµιουργία του πυρήνα της κάτω ελαίας. Επιπλέον δείξαµε ότι το εδαφιαίο πέταλο ασκεί ελκτική δράση στα κύτταρα και των δύο µεταναστευτικών μονοπατιών, καθώς όταν τοποθετηθεί σε έκτοπη θέση, τα κύτταρα παρεκκλίνουν της φυσιολογικής τους πορείας και συσσωρεύονται γύρω από το έκτοπο εδαφιαίο πέταλο. Επίσης, το εδαφιαίο πέταλο φαίνεται ότι παρέχει ένα εξ΄ επαφής σήµα σταµατήµατος των κυττάρων της κάτω ελαίας, τα οποία συσσωρεύονται γύρω από τη συγκεκριµένη δοµή χωρίς να τη διαπερνούν. Έκτοπες πηγές νετρίνης µπορούν να µιµηθούν την ελκτική δράση του εδαφιαίου πετάλου στα κύτταρα του ΟΕΜΜ, τα οποία εκφράζουν τον υποδοχέα της νετρίνης DCC καθόλη τη διάρκεια της µετανάστευσή τους. Αντίθετα τα κύτταρα του ΜΜΚΕ εκφράζουν DCC όταν βρίσκονται κοντά στο ροµβικό χείλος και όταν φτάνουν την τελική τους θέση στη µέση γραµµή, και για αυτό το λόγο η έκτοπη πηγή νετρίνης έλκει τα συγκεκριµένα κύτταρα µόνο όταν βρίσκονται στη ραχιαία πλευρά του νευρικού σωλήνα. Επιπλέον, δείξαµε ότι το σήµα τερµατισµού που παρέχει το εδαφιαίο πέταλο στα κύτταρα του ΜΜΚΕ πιθανόν να είναι η αλληλεπίδραση των µορίων ephrin-B3, που εκφράζεται από τα κύτταρα του εδαφιαίου πετάλου, µε την EphA4, που εκφράζεται από τα κύτταρα του ΜΜΚΕ. Στα ζώα που εµφανίζουν απώλεια δράσης του γονιδίου της EphA4 τα κύτταρα του πυρήνα της κάτω ελαίας δεν έχουν σταµατήσει στη φυσιολογική τους θέση, αλλά ανιχνεύονται και πάνω στη µέση γραµµή. Τα αποτελέσµατα µας δείχνουν ότι σήµατα που δρουν εξ΄επαφής και σήµατα που δρουν εξ΄ αποστάσεως εµπλέκονται στην καθοδήγηση των µεταναστευόντων κυττάρων και των δύο προς µελέτη µονοπατιών. Επιπλέον, µόρια που εµπλέκονται στην καθοδήγηση αναπτυσσόµενων νευραξόνων παίζουν τον ίδιο σηµαντικό ρόλο και στην καθοδήγηση των µεταναστευόντων κυτταρικών σωµάτων.