Μελέτη των μηχανισμών απορρύθμισης της λειτουργίας των ανοσοδραστικών CD4+T κυττάρων από τη V3 περιοχή της γλυκοπρωτεΐνης gp120 του ιού HIV-1

Abstract

The human immunodeficiency virus (HIV) is involved in a number of sophisticated interactions with the human immune system. Asymptomatic infection with HIV is characterized by a chronic activation of the immune system, although the mechanism of this activation is not precisely known. There is mounting evidence that a number of HIV-1 proteins can deregulate the immune system leading to cell apoptosis. The early loss of immune functions in the course of HIV infection is attributed to the preferential loss of uninfected effector/memory (CD45RO+) CD4+ T lymphocytes. As the basic function of these cells is to interact with antigen presenting cells such as macrophages and secrete appropriate cytokines, we investigated the disruption of the antigen presentation process by viral components rather than viral infectivity. The envelope glycoprotein gp120 appears to play a key role in this interaction as it has the ability to react with both CD4 and the chemokine co-receptors CCR5 and CXCR4. The interaction of a host cell with the gp120 results in the induction of an increased sensitivity to apoptosis, which is mediated by the Fas system, as the expression of the anti-apoptotic Bcl-2 is suspended and Caspace 3, is activated. Despite reports of the involvement of the third hypervariable region (V3 loop) of gp120 - the most critical determinant for cellular tropism - in T helper cell dysfunction, the mechanism via which it contributes to the pathogenesis is still not clearly understood. By using primary cells isolated from healthy blood donors and composite liposome particles with exposed V3 lipopeptides from the semi-conserved principal neutralizing domain of V3 of LAI HIV-1 isolate and entrapped tetanus toxoid as a recall antigen (lipo-V3/TT liposomes), we have demonstrated that this special domain of V3 when it is presented on the surface of macrophages delivers a specific signal of activation-apoptosis to normal effector CD4+ T lymphocytes during the process of antigen presentation. Especially, the lipo-V3/TT liposomes are shown to induce a V3-specific response characterised by an early, enhanced proliferation of the above T cells when they are responding to their cognate antigen, followed by a sharp apoptosis. The phenomenon requires the presence of monocyte-derived macrophages and CD4+T cells, but it is qualitatively and quantitatively distinct from the normal soluble antigen-mediated antigen presenting cell -T cell interaction. Presence of the β-chemokine RANTES, an agonist of CCR5 co-receptor, in the culture medium inhibited the phenomenon, suggesting that V3 plays a co-stimulatory role that involves at least the chemokine receptor CCR5 pathway during the process of antigen presentation to T cells. The function of V3 is not therefore restricted to influencing viral entry but it appears that it can also alter the biological behaviour of the recipient host cell. Addressing the question of how a hypervariable region could induce such a selective reaction, we demonstrated that the magnitude of the activation phase was dependent on the number of basic amino acids present in the V3 peptide, an observation confirmed by using V3 peptides from selected subtype B HIV-1 isolates or V3 lipopeptides with appropriate basic amino acid substitutions.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο αποσαφηνισμός πιθανών παθογεννετικών μηχανισμών που φαίνεται να εμπλέκονται στην γενικότερη δυσλειτουργία του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος μετά τη μόλυνση από στελέχη HIV-1. Ειδικότερα η έρευνα εστιάστηκε στα αίτια της επιλεκτικής μείωσης των μη μολυσμένων CD4+ T κυττάρων και τη συσχέτιση αυτού του γεγονότος με το μηχανισμό αντιγονο-παρουσίασης και επακόλουθης ενεργοποίησης του εν λόγω κυτταρικού υποπληθυσμού Για τη μελέτη αναπτύχθηκε ένα καινοτόμο in vitro σύστημα φυσιολογικών ανθρώπινων Τ λεμφοκυττάρων και μακροφάγων μονοκυτταρικής προέλευσης από HIV ορο-αρνητικούς δότες. Η αντιγονοειδική διέγερση των ανοσοδραστικών Τ κυττάρων μνήμης μελετήθηκε παρουσία μεμονωμένων συνθετικών ιικών πεπτιδίων από τη V3 περιοχή της γλυκοπρωτείνης gp120 διαφόρων HIV-1 στελεχών, τα οποία εκτείθεντο υπό τη μορφή λιποπεπτιδίων στην επιφάνεια λιποσωμικών κατασκευών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μεμονωμένα ιικά συστατικά είναι ικανά να προκαλούν ένα ειδικό φαινόμενο ενισχυμένης και πρώιμης ενεργοποίησης των CD4+ Τ κυττάρων κατά τη διάρκεια της απάντησή τους στο αντιγονικό ερέθισμα, η οποία εν συνεχεία ακολουθείται από έντονα αποπτωτικά γεγονότα του ίδιου πληθυσμού. Το βιολογικό φαινόμενο δείχθηκε να αναστέλλεται ειδικά από την παρουσία στην καλλιέργεια του φυσιολογικού δεσμευτή του συνυποδοχέα CCR5, RANTES, ενώ η ένταση της πολλαπλασιαστικής απάντησης φάνηκε να σχετίζεται ανάλογα με τον αριθμό των βασικών αμινοξέων του εκάστοτε V3 πεπτιδίου. Άμεσες ενδείξεις πιθανής αλληλεπίδρασης μεταξύ των εμπλεκόμενων μορίων V3 και CCR5 στο παραπάνω σύστημα προέκυψαν από μελέτες σε κατάλληλο ανιχνευτή μοριακών αλληλεπιδράσεων IBIS. Συνθετικά πεπτίδια από τη V3 περιοχή διαφορετικών ή τροποποιημένων ιικών στελεχών και από το αμινοτελικό άκρο του CCR5 υποδοχέα παρουσίασαν την ικανότητα σχηματισμού συμπλόκων μόνο παρουσία σουλφουρωμένων τυροσινών στη σύσταση του CCR5 πεπτιδίου. Η φύση των παραπάνω αλληλεπιδράσεων φάνηκε να είναι καθαρά ιοντική χωρίς δομικούς περιορισμούς, ενώ η ένταση της αντίδρασης συσχετίστηκε πάλι άμεσα με τον αριθμό των βασικών αμινοξέων του V3 πεπτιδίου. Μελέτες παρεμπόδισης της μόλυνσης πρωτογενών μακροφάγων ή μετασχηματισμένων Τ κυτταρικών σειρών από ιικά στελέχη διαφορετικού τροπισμού με χρήση των παραπάνω συνθετικών V3 πεπτιδίων πιστοποίησαν επιπλέον την επιλεκτική αναστολή της μόλυνσης μόνο από R5 ιούς. Επιπρόσθετα, η δυνατότητα επανάληψης του V3 φαινομένου σε αντίστοιχο κυτταρικό σύστημα συνιστώμενο από μολυσμένα μακροφάγα αποτέλεσε προέκταση των παρατηρήσεών μας σε πιο ρεαλιστικό μοντέλο. Η συλλογή ικανοποιητικών ενδείξεων και αποδείξεων για τον παθογεννετικό μηχανισμό του φαινομένου και κατ’ επέκταση του πιθανού ρόλου του στη γενικότερη δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος in vivo, οδήγησε στη διατύπωση προτεινόμενων υποθέσεων του τρόπου δράσης των ιικών υπομονάδων. Σύμφωνα με το προτεινόμενο μοντέλο, η παρουσία συστατικών του ιού όπως η γλυκοπρωτείνη gp120 στην επιφάνεια μολυσμένων από τον HIV-1 μακροφάγων παρεμβαίνει στο φυσιολογικό μηχανισμό αντιγονο-παρουσίασης μέσω ιοντικής αλληλεπίδρασης της V3 περιοχής της gp120 με την αμινοτελική περιοχή του συνυποδοχέα CCR5 του απαντητικού αναμνηστικού CD4+ T λεμφοκυττάρου. Η ευαισθητοποίηση του εν λόγω φυσιολογικού κυτταρικού υποπληθυσμού σε αποπτωτική πορεία χωρίς την προαπαίτηση μόλυνσης είναι πιθανώς η αναμενόμενη πορεία μιας ανεξέλεγκτης ενεργοποίησης επαγόμενης αθροιστικά από τον αντιγονικό ερεθισμό και την έκθεση στα ιικά συστατικά (activation induced apoptosis). Προκαταρκτικές μελέτες των ενδοκυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών που οδηγούν στην απόπτωση των απαντητικών T κυττάρων στο κυτταρικό μας σύστημα απέδειξαν κατά κύριο λόγο τη συμμετοχή του Fas υποδοχέα. Οι παρατηρήσεις αυτές έρχονται σε συμφωνία με τεκμηριωμένες αναφορές για κινητοποίηση ανάλογων αποπτωτικών μηχανισμών μέσω συμμετοχής του CCR5 υποδοχέα και ιικών μεμβρανικών πρωτεϊνών κατά τη μόλυνση με HIV-1. Τα γενικότερα ευρήματα της παραπάνω μελέτης αποτελούν ουσιαστικό τμήμα των προϋποθέσεων για την κατανόηση και την ολοκλήρωση της μελέτης ενός πολύ σημαντικού παθογεννετικού μηχανισμού που συμμετέχει στην εξέλιξη του AIDS, ενώ παράλληλα θέτουν στέρεες βάσεις για πιθανή διάσπαση του μολυσματικού κύκλου του ιού και αποδοτικότερη μελλοντική διαχείριση της ασθένειας .