Ομοιοστασία πολυαμινών κατά την αύξηση και ανάπτυξη καπνού (Nicotiana tabacum L.) και αμπέλου (Vitis vinifera L.)

Abstract

The polyamines (PAs) spermidine (Spd) and spermine (Spm) and their obligatory precursor, putrescine (Put), are small aliphatic amines, ubiquitous in living organisms. Even though their exact role and function is not yet understood, many studies relate them with a wide range of physiological phenomena, from cellular development and differentiation to stress-induced responses. The preliminary and determinant stage of polyamine biosynthesis is the decarboxylation of ornithine and arginine from the homonymous decarboxylases, to putrescine and agmatine, respectively. Their homeostasis in plant cells is regulated by the rate of their biosynthesis, conjugation and catabolism. In the present study, the homeostasis of polyamines was examined, in an easily regenetated species, the tobacco (Nicotiana tabacum L) and in a woody perennial plant species, the grapevine (Vitis vinifera L.), which does not easily respond to in vitro morphogenic manipulations. Detailed spatial and temporal profiles of the endogenous soluble (S-), soluble-conjugated (SH-) and insoluble-conjugated (PH-) fractions of Put, Spd and Spm are shown in nearly all plant organs of both plant species. The profile of expression of enzymes of PA biosynthesis and catabolism at the transcript, protein and specific activity levels along with the endogenous concentrations of the precursor amino acids arginine and ornithine are also presented. The results reveal that PA titers and biosynthesis follow a basipetal decrease along the tobacco plant axis; the transcripts of the genes encoding the arginine decarboxylase (ADC), S-adenosyl-L-methionine decarboxylase (SAMDC) and spermidine synthase (SPDS) enzymes and ADC protein do not coincide with enzyme activities in the youngest tissues; Spd synthesis strongly correlates with intense cell divisions; the S-/tot-PA ratios gradually increase basipetally, whereas the conjugated PAs decrease with Spd to mainly determine these changes; total leaf size negatively correlates with PA titers and synthesis; PA biosynthetic enzymes are down-regulated during development; the titers of Arg and Orn and arginase activity increase with age; the shoot apical meristem is the main site of Spd and Spm biosynthesis, whereas the root synthesizes mostly Put. Analysis of Nicotiana tabacum plants also reveals temporally and spatially discrete patterns of di- and polyamine oxidases (DAO and PAO), peroxidases (POXs) and putrescine N-methyltransferase (PMT) expression in shoot apical cells, leaves (apical, peripheral and central regions), acropetal and basipetal petiole regions, internodes, young and old roots. Enzyme activity assays show that DAO preferentially oxidizes the aliphatic diamine putrescine, whereas PAO oxidizes the triamine spermidine and, preferentially, the tetramine spermine.

Οι πολυαμίνες (ΠΑ) σπερμιδίνη (Spd) και σπερμίνη (Spm) και ο υποχρεωτικός πρόδρομος τους, η πουτρεσίνη (Put), είναι μικρές αλειφατικές αμίνες που βρίσκονται σε όλα τα κύτταρα. Αν και ο ακριβής ρόλος τους και ο τρόπος δράσης τους δεν έχει, ακόμα, γίνει κατανοητός, πολυάριθμες μελέτες τις συνδέουν με ποικίλες φυσιολογικές διαδικασίες, που περιλαμβάνουν από την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση έως και την απόκριση σε συνθήκες καταπόνησης. Το αρχικό και καθοριστικό στάδιο της βιοσύνθεσης των πολυαμινών είναι η αποκαρβοξυλίωση της ορνιθίνης και της αργινίνης από τις ομώνυμες αποκαρβοξυλάσες, προς πουτρεσίνη και αγματίνη, αντίστοιχα. Η ομοιοστασία τους στα κύτταρα των φυτών ρυθμίζεται από το βαθμό βιοσύνθεσης, σύζευξης και καταβολισμού τους. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ομοιοστασία των ΠΑ σε ένα εύκολα αναγεννώμενο είδος, τον καπνό (Νicotiana tabacum L.) και σε ένα πολυετές φυτικό είδος, την άμπελο (Vitis vinifera L.), το οποίο δεν αποκρίνεται εύκολα σε in vitro μορφογενετικούς χειρισμούς. Παρουσιάζονται αναλυτικά χωρoταξικά και χρονικά σχεδιαγράμματα των ενδογενών διαλυτών (S-), διαλυτών συζευγμένων (SH-) και αδιάλυτων συζευγμένων (PH-) κλασμάτων της Put, Spd και Spm σχεδόν σε όλα τα όργανα και των δύο φυτικών ειδών. Επίσης, μελετήθηκε η κατατομή της έκφρασης των ενζύμων βιοσύνθεσης και καταβολισμού των ΠΑ σε επίπεδα μεταγράφων, πρωτεϊνών και ειδικών ενεργοτήτων, μαζί με τις ενδογενείς συγκεντρώσεις των προδρόμων αμινοξέων αργινίνης και ορνιθίνης. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι οι ενδογενείς συγκεντρώσεις και η βιοσύνθεση των ΠΑ ακολουθούν μια βασιπέταλη μείωση κατά μήκος του άξονα των φυτών καπνού. Τα μετάγραφα των γονιδίων που κωδικοποιούν τα ένζυμα ADC, SAMDC και SPDS, καθώς και η πρωτεΐνη της ADC δε συμπίπτουν με τις ενζυμικές ενεργότητες στους νεώτερους ιστούς. Η σύνθεση της Spd συσχετίζεται ισχυρά με τις έντονες κυτταροδιαιρέσεις. Οι σχετικές αναλογίες S/tot-ΠΑς αυξάνονται βαθμιαία βασιπέταλα, ενώ οι συζευγμένες ΠΑς μειώνονται, με τη Spd να καθορίζει κυρίως αυτές τις αλλαγές. Το συνολικό μέγεθος φύλλων συσχετίζεται αρνητικά με τις ενδογενείς συγκεντρώσεις και τη σύνθεση ΠA. Τα βιοσυνθετικά ένζυμα ΠA υποεκφράζονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Οι ποσότητες των Arg και Orn και η ενεργότητα της αργινάσης αυξάνονται με την ηλικία. Το ακραίο μερίστωμα του βλαστού είναι η κύρια περιοχή σύνθεσης των Spd και Spm, ενώ η ρίζα είναι η κύρια περιοχή σύνθεσης της Put.