Ανάπτυξη και αξιολόγηση ραδιοεπισημασμένων συνθετικών αναλόγων της σωματοστατίνης για την in vivo εντόπιση νεοπλασμάτων

Abstract

The overexpression of somatostatin receptor subtype 2 (sst2) in many neoplasms of mainly neuroendocrine origin has resulted in an established method for the in vivo diagnostic imaging of sst2-positive tumors using OctreoScan® ([111Ιn-DTPA0]octreotide). Despite its initial success, OctreoScan®’s broader application is hampered by using 111In. Given that, 99mTc still remains the ideal diagnostic radionuclide of nuclear medicine due to important practical and financial advantages the development of a specific sst2-seeking [99mTc]-radiotracer as an alternative to OctreoScan® is highly attractive. In the present thesis, the synthesis and the biological evaluation of two novel somatostatin peptide analogs, functionalized at the N-terminus with an acyclic tetraamine chelator for effective 99mTc binding: Demotide ([Ν40,Tyr3]octreotide) and Demotate ([Ν40,Tyr3]octreotate) differing only at the C-terminus (Thr(ol)8 versus Thr8-OH, respectively), is described. Synthesis of Demotide was performed in solution whereas Demotate was synthesized on the solid support. Identification of new analogs comprised ESI-MS and RP-HPLC. Their binding affinity for sst2 was determined by competition binding experiments in sst2-positive rat brain cortex or AR4-2J and CA20948 cell membranes. Their hsst1-5 binding profile was determined by in vitro receptor autoradiography. Labeling with 99mTc led to [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate. The radiopeptide affinity for the sst2 was determined by saturation binding assays in AR4-2J membranes and their internalization was tested in AR4-2J cells. Biodistribution was studied in healthy (Swiss albino mice and Wistar rats) and pathological animal models (AR4-2J tumor-bearing Swiss nu/nu mice and CA20948 tumor-bearing Lewis rats). In conclusion, [99mTc]Demotide and [99mTc]Demotate satisfied important criteria and combined a variety of favorable properties for successful application in the targeted diagnostic imaging of sst2-positive tumors in man, such as favorable pharmacokinetics, metabolic stability as well as rapid and high in vivo sst2-targeting. These characteristics provide the prospect to implement a logistically convenient one-day clinical protocol (99mTc: t½= 6.02 h) without compromising image quality. Such a protocol will facilitate the patient management in clinical practice in comparison to OctreoScan® (111In: t½= 67.2 h). The latter is more suitable for a two-day examination protocol according to the manufacturer’s suggestion. Further studies are expected to confirm their potential diagnostic value in the clinic.

____Η υπερέκφραση υποδοχέων σωματοστατίνης υπότυπου 2 (sst2) σε πολλά νεοπλάσματα νευροενδοκρινικής κυρίως προέλευσης έχει συντελέσει στην εφαρμογή μεθόδου in vivo διαγνωστικής απεικόνισης sst2-θετικών όγκων με το εμπορικό σκεύασμα OctreoScan® ([111Ιn-DTPA0]octreotide). Παρά την αρχική του επιτυχία, η ευρύτερη εφαρμογή του OctreoScan® περιορίζεται λόγω του 111In. Δεδομένου ότι το 99mTc παραμένει το ιδανικό διαγνωστικό ραδιονουκλίδιο της πυρηνικής ιατρικής λόγω σημαντικών πρακτικών και οικονομικών πλεονεκτημάτων, η ανάπτυξη ενός [99mTc]-ραδιοϊχνηθέτη εναλλακτικού του OctreoScan® είναι ιδιαίτερα ελκυστική. Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται η σύνθεση και η βιολογική αξιολόγηση δύο νέων αναλόγων της σωματοστατίνης τροποποιημένων με τετρααμίνη ανοικτής αλυσίδας για σταθερή δέσμευση του 99mTc: Demotide ([Ν40,Tyr3]octreotide) και Demotate ([Ν40,Tyr3]octreotate), τα οποία διαφέρουν στο C-τελικό αμινοξύ (Thr(ol)8 και Thr8-OH, αντίστοιχα). Η σύνθεση του Demotide πραγματοποιήθηκε σε διάλυμα ενώ του Demotate σε στερεή φάση. Η ταυτοποίησή τους έγινε με ESI-MS και RP-HPLC. Η συγγένεια δέσμευσης των δύο νέων αναλόγων για τον sst2 προσδιορίστηκε με πειράματα ανταγωνιστικής δέσμευσης σε φλοιό εγκεφάλου επίμυα και σε μεμβράνες sst2-θετικών κυττάρων AR4-2J και CA20948. Η αξιολόγηση της συγγένειάς τους στους υπότυπους hsst1-5 μελετήθηκε με in vitro αυτοραδιογραφία υποδοχέων. Μετά την επισήμανση με 99mTc προέκυψαν τα [99mTc]Demotide και [99mTc]Demotate. Η ικανότητα δέσμευσής τους στον sst2 μελετήθηκε με πειράματα κορεσμού σε μεμβράνες AR4-2J ενώ η εσωτερίκευσή τους ελέγχθηκε σε κύτταρα AR4-2J. Η βιοκατανομή τους μελετήθηκε σε υγιή (ποντίκια Swiss albino και επίμυες Wistar) και παθολογικά πρότυπα πειραματοζώων (άθυμα ποντίκια Swiss nu/nu με όγκους AR4-2J και επίμυες Lewis με όγκους CA20948). Συμπερασματικά, τα [99mTc]Demotide και [99mTc]Demotate ικανοποίησαν και συνδύασαν σημαντικά κριτήρια για επιτυχή εφαρμογή στην στοχευμένη διαγνωστική απεικόνιση sst2-θετικών όγκων στον άνθρωπο, όπως ευνοϊκή βιοκινητική, μεταβολική σταθερότητα και ταχεία και υψηλή ικανότητα in vivo στόχευσης των sst2. Αυτό αναμένεται να επιτρέψει την εφαρμογή διαγνωστικού κλινικού πρωτοκόλλου μίας ημέρας (99mTc: t½= 6.02 h) χωρίς να “θυσιάζεται” η ποιότητα της απεικόνισης. Με αυτό τον τρόπο διευκολύνεται η διαχείριση των ασθενών στην κλινική πράξη σε σύγκριση με το OctreoScan® (111In: t½= 67.2 h), το οποίο είναι περισσότερο κατάλληλο για πρωτόκολλο δύο ημερών, όπως συνιστάται άλλωστε για την επιτυχέστερη κλινική του εφαρμογή. Περαιτέρω μελέτες αναμένεται να επιβεβαιώσουν την πιθανή διαγνωστική τους αξία στην κλινική πράξη.