Μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21WAF1/Cip-1 του ανθρώπου

Abstract

p21WAF1/Cip1 (p21) plays an essential role in important biological processes such as cell growth, differentiation etc. acting as an inhibitor of the cell cycle in G1 and G2. Under conditions of p21 gene induction by extracellular factors such as cytokines, genotoxic stress or differentiation factors, p21 represses the activity of cyclin/CDK (Cyclin-Dependent Kinase) complexes and the activity of PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) which is a subunit of DNA Polymerase δ, resulting in the inhibition of DNA synthesis during S phase. In the present dissertation, we studied the molecular mechanisms that control p21 gene expression at the transcriptional level. In the first part, we have undertaken a functional characterization of the proximal p21 promoter and we found that two members of the Sp1 family of transcription factors (Sp1 and Sp3) bound, with different affinity, to six binding sites present in the proximal region between nucleotides -120 and -45 that were named Sp1 sites 1-6. Mutagenesis of these sites combined with transient transfections of SL2 cells that lack endogenous Sp1 or related activities, showed that sites 1 and 2 are important for the transactivation of the p21 promoter by Sp1 and Sp3. Utilizing a mutant Sp1 lacking the oligomerization domain D (Sp1 ΔD) we showed that the transactivation of the p21 promoter is accomplished by synergistic interactions between Sp1 proteins bound to adjacent sites on the proximal region. In the second part, we characterized the distal region of the p21 promoter by mutagenesis and by constructing artificial promoters and we found that the region between nucleotides -2,325 to -2,280, that includes a binding site for the tumor suppressor p53 protein, is a strong transcriptional enhancer of the p21 gene in human hepatome HepG2 cells. We showed that p53 cannot transactivate the p21 promoter in SL2 cells that lack endogenous Sp1 and Sp3 and that the p53-mediated transactivation of the p21 promoter is inhibited by mutations in Sp1 site 3. In parallel, we showed that none of the 6 Sp1 sites is necessary for the transactivation of the p21 promoter by Smad proteins which are mediators of the Transforming Growth Factor β (TGFβ) signaling pathway. Based on these findings, we proposed that p21 promoter is regulated by physical and functional interactions between p53 bound to the distal region and Sp1 or Sp3 bound to the proximal promoter region. Direct binding of Sp1 and Sp3 to p53 was shown both in vitro and in vivo. We found that Sp1 domains A, B and DBD interact with the C-terminal region of p53 (amino acids 293-393) whereas a mutant p53 that lacks the above region could not transactivate the p21 promoter. We also found that Sp1 and Sp3 physically and functionally interact with p73 which is homologous to p53 but is expressed in a cell specific manner. In the third part of the dissertation, we investigated the importance of Sp1 in cell processes that are mediated by p53 such as genotoxic stress induced by chemotherapeutic drugs. We found that the anticancer drug 5-Fluorouracil (5-FU) induces the transcription of the p21 gene only in cells that express a functional p53 protein. p53 activation by 5-FU is caused by the site-specific phosphorylation at serine 15. We also found that Mithramycin, a compound that is used for the treatment of Paget’s disease and in certain forms of cancer, has a dual effect on cells. On one hand, it strongly activates p53 by a similar mechanism to 5-FU i.e. by phosphorylation at serine 15. On the other hand, Mithramycin, due to its property to inhibit the binding of Sp1 to GC-rich motives in the promoters of genes, represses the transcriptional induction of the p21 and PUMA (p53-Upregulated Mediator of Apoptosis) genes by 5-FU but has no effect on the basal levels of transcription of the above genes. Finally, we showed that Mithramycin is a strong apoptotic inducer in HepG2 cells presumably due to the inhibition of p21 gene induction by this drug. In summary, the results of the present dissertation show that transcriptional activation of p21 gene requires a number of protein-protein interactions between factors that bind to the distal p21 promoter region and factors that bind to the proximal p21 promoter region. Repression of these interactions inhibits cell cycle arrest by p21, resulting in uncontrolled cell proliferation. These results also support an important role of Sp1 transcription factor in the basal and the inducible activity of the p21 gene. The p21 protein, due to its cell cycle inhibitory properties, is a prime tool for the treatment of disease of uncontrolled cell proliferation. Understanding the molecular mechanisms of p21 gene regulation is of outmost importance for anticancer research.

Η πρωτεΐνη p21WAF1/Cip1 (p21) παίζει σημαντικό ρόλο σε βιολογικές διεργασίες όπως η κυτταρική ανάπτυξη, η διαφοροποίηση κ.α. δρώντας ως αναστολέας του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G1 και G2. Σε συνθήκες επαγωγής της έκφρασης της p21 από εξωκυττάριους παράγοντες όπως κυτταροκίνες, γενοτοξικό στρες ή παράγοντες διαφοροποίησης, η p21 καταστέλλει την δράση των συμπλόκων που σχηματίζονται μεταξύ κυκλινών και κινασών που εξαρτώνται από τις κυκλινες (cyclin/CDKs) και την λειτουργία της πρωτεΐνης PCNA η οποία αποτελεί υπομονάδα της DNA πολυμεράσης δ με αποτέλεσμα την καταστολή της σύνθεσης του DNA κατά την φάση S και την αναστολή του κυτταρικού κύκλου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους ρυθμίζεται η έκφραση του γονιδίου p21 σε μεταγραφικό επίπεδο. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εκπονήσαμε τον λειτουργικό χαρακτηρισμό της κοντινής περιοχής του υποκινητή του γονιδίου p21 και βρήκαμε ότι δυο μέλη της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων Sp1 (Sp1 και Sp3) προσδένονται, με διαφορετική συνάφεια, σε έξι διαφορετικές θέσεις που ονομάστηκαν Sp1 θέσεις 1-6 και χαρτογραφούνται στην περιοχή του υποκινητή που περιλαμβάνεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων -120 και -45. Με μεταλλαξιογέννεση των θέσεων αυτών και παροδικές επιμολύνσεις κυττάρων SL2 τα οποία στερούνται ενδογενών Sp1 παραγόντων, δείξαμε ότι οι θέσεις 1 και 2 είναι απαραίτητες για την μεταγραφική ενεργοποίηση από τους παράγοντες Sp1 και Sp3. Χρησιμοποιώντας μια μεταλλαγμένη μορφή του παράγοντα Sp1 η οποία στερείται της περιοχής ολιγομερισμού (Sp1 ΔD) δείξαμε ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου p21 επιτυγχάνεται μέσω συνεργασιακών αλληλεπιδράσεων μεταξύ Sp1 πρωτεϊνών που προσδένονται σε γειτονικές θέσεις του κοντινού υποκινητή. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής αναλύσαμε την μακρινή περιοχή του p21 υποκινητή με μεταλλαξιογέννεση και με την δημιουργία συνθετικών υποκινητών και βρήκαμε ότι η περιοχή -2,325 έως -2,280, η οποία περιλαμβάνει μια θέσης πρόσδεσης της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53, δρα σαν μεταγραφικός ενισχυτής του γονιδίου σε κύτταρα ηπατώματος HepG2. Βρήκαμε ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου p21 από την p53 δεν μπορεί να επιτευχθεί σε κύτταρα SL2 που στερούνται ενδογενών Sp1 παραγόντων και ότι καταστέλλεται από την μεταλλαξιογέννεση της Sp1 θέσης 3 στον κοντινό υποκινητή. Παράλληλα δείξαμε ότι καμία από τις 6 θέσεις πρόσδεσης του Sp1 δεν είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση του p21 υποκινητή από τις πρωτεϊνες Smad που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι του TGFβ. Τα παραπάνω αποτελέσματα μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι η ενεργοποίηση του p21 υποκινητή απαιτεί λειτουργικές και φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της p53 που προσδένεται στον ενισχυτή και των παραγόντων Sp1 και Sp3 που προσδένονται στην κοντινό υποκινητή. Η άμεση πρόσδεση των Sp1 και Sp3 στην p53 αποδείχθηκε με αναλύσεις πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων τόσο σε συνθήκες in vitro όσο και in vivo. Βρήκαμε ότι οι περιοχές A, B και DBD της Sp1 αλληλεπιδρούν με την C-τερματική περιοχή 293-393 της p53 ενώ μια μεταλλαγμένη μορφή της p53 η οποία στερούνταν της ανωτέρω περιοχής δεν είχε την δυνατότητα μεταγραφικής ενεργοποίησης του p21 υποκινητή. Δείξαμε επίσης ότι οι πρωτεϊνες Sp1 και Sp3 αλληλεπιδρούν φυσικά και λειτουργικά και με την p73 η οποία είναι ομόλογη της p53 αλλά εκφράζεται σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, διερευνήσαμε την σημασία του παράγοντα Sp1 σε κυτταρικές διεργασίες που διαμεσολαβούνται από την p53 όπως το γενοτοξικό στρες. Βρήκαμε ότι η χημειοθεραπευτική ένωση 5-φθοροουρακίλη (5-FU) προκαλεί μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου p21 μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν φυσιολογική p53. H ενεργοποίηση της p53 από την 5-FU επιτελείται μέσω φωσφορυλίωσης στην σερίνη 15. Βρήκαμε επίσης ότι η ένωση Μιθραμυκίνη, η οποία χρησιμοποιείται για την θεραπεία της νόσου του Paget και ως αντικαρκινικό, έχει διπλή δράση στα κύτταρα στόχους. Από τη μια μεριά ενεργοποιεί ισχυρά την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της 5-FU δηλ. με το να προκαλεί τη φωσφορυλίωσή της στη σερίνη 15. Από την άλλη μεριά, η Μιθραμυκίνη, λόγω της ικανότητάς της να παρεμποδίζει την πρόσδεση του παράγοντα Sp1 σε πλούσια σε GC μοτίβα στους υποκινητές γονιδίων, καταστέλλει τη μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων p21 και PUMA από ενώσεις όπως η 5-FU ενώ δεν επηρεάζει τα βασικά επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων αυτών. Τέλος, βρήκαμε ότι η Μιθραμυκίνη προκαλεί ισχυρή απόπτωση στα κύτταρα HepG2 πιθανόν λόγω της ιδιότητάς της να καταστέλλει την έκφραση της p21. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου p21 απαιτεί ένα σύνολο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ παραγόντων που προσδένονται στη μακρινή περιοχή και παραγόντων που προσδένονται στην κοντινή περιοχή του υποκινητή του γονιδίου. Αναστολή των αλληλεπιδράσεων αυτών δεν επιτρέπει τη βιολογική απόκριση του γονιδίου p21, με συνέπεια να παρεμποδίζεται η αναστολή του κυτταρικού κύκλου και να ευνοείται ο ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Επίσης, τα αποτελέσματά μας ενισχύουν το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 τόσο στην βασική έκφραση του γονιδίου p21 όσο και στην επαγόμενη έκφραση από κυτταροκίνες όπως ο TGFβ και χημειοθεραπευτικές ενώσεις όπως η 5-FU. Η πρωτεΐνη p21, λόγω της ικανότητάς της να αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο, αποτελεί ένα πρώτης τάξεως εργαλείο για την καταπολέμηση νοσημάτων που χαρακτηρίζονται από ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό όπως ο καρκίνος και κατά συνέπεια η γνώση των μοριακών μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου p21 είναι πρωταρχικής σημασίας για την αντικαρκινική έρευνα.