Αστάθεια μικροδορυφορικού DNA σε καρκίνους και προκαρκινικές αλλοιώσεις του γυναικείου γεννητικού συστήματος

Abstract

Carcinoma of the cervix is one of the most common tumors affecting women world-wide, both in incidence and mortality, predominantly in the developing countries, with approximately 500 000 new cases diagnosed annually. The existing screening methods for cervical cancer such as Pap smear, cancer biochemical markers and colposcopy fail to detect early enough, a significant percentage of cervical cancer or CIN cases. The genetic events implicated in the initiation and progression of this disease remain an important challenge in gynecological research. Great improvements has been achieved in defining gene defects and in discovering new genes that are involved in this disease. The microsatellite alterations (MA), such as Microsatellite Instability (MIN) and Loss of Heterozygocity (LOH) seem to play an important role among the molecular approaches of studying the disease. It has been suggested that the detection of instability of the genome might be useful in the early detection of human cancers. The purpose of this study was whether MIN and LOH phenomena can be detected in DNA extracted from solid tumors and cytological material of patients with cervical cancer (CC) or cervical intraepithelial neoplasia (CIN). The demonstration of genetic imbalance in exfoliated cervical cells might be a new screening test for early detection or a supplementary diagnostic method for CC and CIN. It could also contribute in a closer screening approach for high risk women for the disease. Using polymerase chain reaction-based microsatellite analysis and 18 microsatellite markers we examined samples obtained from 63 patients with CIN, 40 patients with CC and 20 healthy donors. These 18 markers are located at p16, BRCA2, p53, BRCA1 and candidate tumor suppressor loci, on 9pter-p13, 13q12, 17p13, 17q11-q22 and 9q32-q34, respectively. Our microsatellite DNA assay for the 18 examined markers demonstrated 87,5% incidence of LOH. The 9pter-p13 locus was affected in 67,5% of cases approximately 2-, 3- and 5-fold more frequently than 13q12, 9q32-q34 and 17q12-q22, respectively. LOH phenomenon was detected in 55.5% of patients with CIN. The 9pter-p13 was affected in 41.3% of cases approximately 2-, 4- and 5-fold more frequently than 13q12, 9q32-q34 and 17q12-q22, respectively. MIN was detected in 7.4% of patients with CC while none of the CIN patients fulfilled the criterion of the co-finding of at least five markers to be characterized as MIN positive phenotype. However the latter does not diminish the importance of MIN detection since this subset of tumors possibly harbors alterations in the mismatch DNA repair system and therefore may represent a distinct pathway of cervical carcinogenesis. None of the healthy donors exhibited any genetic alterations. We conclude that microsatellite markers which are located on 9pter-p13 region proximal to 9p21 region where p16 gene is mapped reveal an increase of allelic imbalance, while distal from this region LOH frequency declined. Therefore, p16 gene might be implicated in the pathogenesis of CC and CIN. High instability of microsatellite markers near p16 gene in solid tumor or exfoliative cells of the female genital tract might prove helpful in diagnosing the dysplastic lesions of the cervix or a predisposition to it. We showed for the first time in specimens with CIN and early stages of CC that microsatellite alterations is a detectable phenomenon in the exfoliated cells of the female genital tract with possible clinical application in early detection of CC or CIN. From our results we could conclude that LOH and MIN phenomena might be used as a non-invasive, inexpensive and relatively easy performed screening test for CC and CIN in cytological material.

Ο γυναικολογικός καρκίνος αποτελεί συχνή αιτία θανάτου του γυναικείου πληθυσμού. Μάλιστα ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ένας από τους πιο συνήθεις όγκους σε συχνότητα και θνητότητα που προσβάλλει τις γυναίκες παγκοσμίως. Ιδίως σε αναπτυγμένες χώρες εμφανίζονται περίπου 500.000 νέες περιπτώσεις κάθε χρόνο. Οι υπάρχουσες διαγνωστικές μέθοδοι για πρώιμη διάγνωση του καρκίνου του τραχήλου όπως test-Pap, βιοχημικοί δείκτες, κολποσκόπηση κτλ, αδυνατούν να ανιχνεύσουν καρκίνο ή ενδοεπιθηλιακή δυσπλασία τραχήλου σε πρώιμα στάδια. Η γενετική βάση του γυναικολογικού καρκίνου αποτελεί αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητών τελευταία και έχει επιτευχθεί μεγάλη πρόοδος στον προσδιορισμό αλλοιώσεων σε συγκεκριμένα γονίδια και στον εντοπισμό επιπρόσθετων γονιδίων που εμπλέκονται σ’ αυτό. Ανάμεσα στις διάφορες μοριακές προσεγγίσεις για τη μελέτη του προβλήματος, σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει η αστάθεια του γενετικού υλικού είτε με τη μορφή της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA (ΜΙΝ) είτε με τη μορφή της απώλειας της ετεροζυγωτίας (LOH). Έχει προταθεί ότι η ανίχνευση αστάθειας στο γενετικό υλικό μπορεί να χρησιμεύσει στην πρώιμη διάγνωση ανθρώπινων κακοηθειών. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανίχνευση MIΝ και LOH όχι μόνο σε συμπαγή όγκο αλλά και σε κυτταρολογικό επίχρισμα ασθενών με τραχηλική ενδοεπιθηλιακή δυσπλασία (CIN) ή καρκίνο. Η ύπαρξη τέτοιων αλλοιώσεων στο κυτταρολογικό υλικό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν αυτοδύναμη μέθοδος ή συμπληρωματική στις ήδη υπάρχουσες για την πρώιμη ανίχνευση και διάγνωση καρκίνου ή ενδοεπιθηλιακής δυσπλασίας τραχήλου. Θα μπορούσε ακόμα να συμβάλει στην αποτελεσματική παρακολούθηση γυναικών που ανήκουν σε ομάδες υψηλού κινδύνου για την εμφάνιση της νόσου. Μελετήθηκαν συνολικά 103 ασθενείς, 63 με ενδοεπιθηλιακή δυσπλασία τραχήλου (CIN) και 40 με καρκίνο τραχήλου μήτρας (CC). Επίσης στη μελέτη πήραν μέρος 20 υγιείς εθελόντριες. Χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και 18 μικροδορυφορικοί δείκτες για την ενίσχυση των προς έλεγχο περιοχών. Οι μικροδορυφορικοί αυτοί δείκτες εντοπίζονται στις περιοχές 9pter-p13, 17q11-q22, 13q12, 17p13 και 9q32-34, όπου εδράζονται τα ογκοκατασταλτικά γονίδια p16, BRCA1, BRCA2, p53 καθώς και το υποτιθέμενο (candidate) ογκοκατασταλτικό γονίδιο αντίστοιχα. Η ανάλυση των δειγμάτων της μελέτης έδειξε την παρουσία LOH στο 87.5% των ασθενών με καρκίνο τραχήλου μήτρας. Η περιοχή 9pter-p13 παρουσίασε LOH σε ποσοστό 67.5% δηλαδή 2, 3 και 5 φορές συχνότερα σε σύγκριση με τις περιοχές 13q12, 9q32-34 και 17q11-q22 αντίστοιχα. Όσον αφορά τις περιπτώσεις CIN το 55.5% των ασθενών εμφάνισε LOH. Και σε αυτή την περίπτωση η περιοχή 9pter-p13 παρουσίασε το υψηλότερο ποσοστό LOH (41.3%) δηλαδή 2, 4 και 5 φορές υψηλότερο σε σύγκριση με τις περιοχές 13q12, 9q32-34 και 17q11-q22 αντίστοιχα. MIΝ ανιχνεύθηκε στο 7.4% των ασθενών με καρκίνο τραχήλου μήτρας, ενώ κανένας από τους ασθενείς με CIN δεν εμφάνισε το φαινόμενο λαμβάνοντας υπόψιν ότι για να χαρακτηρισθεί ένας ασθενής ΜΙΝ θετικός θα πρέπει να παρουσιάζει ΜΙΝ σε 5 τουλάχιστον δείκτες. Βέβαια το μικρό ποσοστό ΜΙΝ στη μελέτη μας δεν μειώνει την αξία της ανίχνευσής του. Με δεδομένη την κλωνική φύση του καρκίνου η ύπαρξη τέτοιων αλλοιώσεων αντανακλά βλάβες στο σύστημα επιδιόρθωσης του DNA των κυττάρων και μπορεί να καταδεικνύει κύτταρα αυξημένης επιθετικότητας. Καμία από τις 20 υγιείς εθελόντριες δεν εμφάνισε αστάθεια μικροδορυφορικού DNA ή απώλεια ετεροζυγωτίας στους 18 δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι οι μικροδορυφορικοί δείκτες οι οποίοι εντοπίζονται στην περιοχή 9pter-p13 εμφανίζουν υψηλό ποσοστό αστάθειας. Η περιοχή αυτή βρίσκεται, εγγύς στην περιοχή 9p21 όπου εδράζεται το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p16 ενώ περιφερικά της περιοχής αυτής το φαινόμενο εξασθενεί. Επομένως, το γονίδιο p16 ίσως να εμπλέκεται στην παθογένεια του καρκίνου και των ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας. Ανίχνευση υψηλού ποσοστού αστάθειας σε ιστό ή κυτταρολογικό υλικό τραχήλου μήτρας, σε μικροδορυφορικούς δείκτες κοντά στο γονίδιο p16, θα μπορούσε να σημαίνει ότι ήδη υπάρχει βλάβη στον τράχηλο (καρκίνος ή ενδοεπιθηλιακή δυσπλασία) ή ότι η ασθενής έχει προδιάθεση να την αναπτύξει μελλοντικά. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι αλλοιώσεις μικροδορυφορικού DNA είναι ανιχνεύσιμο φαινόμενο στο κυτταρολογικό υλικό ασθενών με CIN. Με βάση τα αποτελέσματά μας θα μπορούσαμε να πούμε ότι η ανίχνευση των φαινομένων LOH και ΜΙΝ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν μια μη επεμβατική, φθηνή και σχετικά εύκολη μέθοδος ανίχνευσης καρκίνου τραχήλου μήτρας ή CIN στο κυτταρολογικό υλικό.