Μελέτη της έκφρασης της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2 στους κυτταρικούς πληθυσμούς του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση και σαρκοείδωση

Abstract

BACKGROUND-AIM. Apoptosis, also known as programmed cell death is a normal procedure at importance in the ''homeostasis'' of multicellular organisms. Apoptotic cellular death probably correlates to the pathophysiologic mechanisms of alveolitis in sarcoidosis and idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). Our purpose was to investigate changes in the expression of the antiapoptotic protein bcl-2, one of the most important inhibiting factors of apoptosis, on bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cell populations in patients with IPF and sarcoidosis. MATERIALS AND METHODS. Fiberoptic bronchoscopy and BAL was performed in 15 patients with IPF and 13 patients with sarcoidosis (10 patients with stage I and 3 with stage II disease based on chest radiography). None of them was under treatment with corticosteroids or other immunosuppressive agents. For comparison and statistical evaluation of results, 10 normal subjects served as control group (nonsmokers, with normal chest radiography and spirometry). BAL was performed in the area of maximal radiographic shadowing (based on high-resolution computed tomography findings) at patients with IPF and sarcoidosis stage II and in the middle lobe or lingula in cases of stage I sarcoidosis or normal subjects Differential counts of BAL cell types were determined by microscopic observation after staining with Giemsa and Papanikolaou stain. Cellular bcl-2 expression was identified using an immunoperoxidase staining method with monoclonal anti-bcl-2 antibodies. RESULTS A statistically significant (p<0,001) increase in the expression of bcl-2 in BAL neutrophils and eosinophils was observed in patients with IPF compared to controls. BAL macrophages exhibited a slight (statistically insignificant) increase in bcl-2 expression in IPF patients. No bcl-2 expression was observed in BAL lymphocytes from IPF patients in contrast to the control group, where this certain protein was expressed in approximately one third of the cases. Both lymphocytes and macrophages in sarcoid patients' BAL exhibit a significant increase in the expression of bcl-2 compared to control group (p<0,001). On the contrary, no expression of bcl-2 was observed on neutrophils and eosinophils nor in the sarcoid patients group either in the normal volunteer control group. CONCLUSIONS. Our results suggest that the antiapoptotic protein bcl-2 is overexpressed (in statistically significant percentage) on BAL neutrophils and eosinophils in IPF patients and on lymphocytes and macrophages in sarcoid patients, namely the cells that characterise the special cellular profile of each one of these diseases. This finding probably correlates with the pathophysiologic mechanisms of these diseases because apoptosis resistance means prolongation of cellular survival and cellular resistance against factors that promote its functional impairment and consequent destruction. In addition to the information on pathophysiological facts at alveolar level obtained by the study of bcl-2, our data could also prove to be a useful marker of disease activity (IPF or sarcoidosis) and probably it's response to treatment.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΚΟΠΟΣ. Η απόπτωση, γνωστή και ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος αποτελεί ένα φυσιολογικό φαινόμενο με ιδιαίτερη σημασία στις διαδικασίες ομοιόστασης των πολυκύτταρων οργανισμών. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος πιθανόν σχετίζεται με τα παθοφυσιολογικά ''δρώμενα'' στην κυψελιδίτιδα της σαρκοείδωσης και της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (ΙΠΙ). Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν η ανεύρεση διαφοροποιήσεων στην έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης bcl-2, ενός από τους πλέον σημαντικούς ανασταλτικούς παράγοντες της απόπτωσης, στους κυτταρικούς πληθυσμούς του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL) ασθενών με ΙΠΙ και σαρκοείδωση. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟ∆ΟΣ. ∆ιενεργήθηκε βρογχοσκοπικός έλεγχος και ΒΑL σε 15 ασθενείς με ΙΠΙ, 13 ασθενείς με σαρκοείδωση (δέκα με νόσο σταδίου 1 και τρείς με σταδίου 2) και10 υγιείς μάρτυρες. Κανείς εκ των ασθενών που μελετήθηκαν δεν ελάμβανε κορτικοειδή ή άλλα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα. Η λήψη του BAL γινόταν από τις περιοχές των μεγίστων αλλοιώσεων (με βάση τα ευρήματα της αξονικής ομογραφίας θώρακος υψηλής ευκρίνειας) στις περιπτώσεις ΙΠΙ και σαρκοειδώσεως σταδίου 2 και από την περιοχή του μέσου λοβού ή της γλωσσίδος στις περιπτώσεις των υγιών μαρτύρων και σαρκοειδώσεως σταδίου 1. Ο καθορισμός της ποσοστιαίας αναλογίας των επιμέρους κυττάρων γινόταν με μικροσκοπική παρατήρηση μετά από εφαρμογή χρώσεων Giemsa και Παπανικολάου. Ο προσδιορισμός της κυτταρικής έκφρασης της bcl-2 γινόταν με χρήση ανοσοïστοχημικής χρώσης (μέθοδος αλκαλικής φωσφατάσης) και μονοκλωνικών αντι-bcl-2 αντισωμάτων. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. Στις περιπτώσεις των ασθενών με ΙΠΙ διεπιστώθει μια στατιστικώς σημαντική (p<0,001) αύξηση στην έκφραση της bcl-2 στα πολυ μορφοπύρηνα και ηωσινόφιλα του BAL σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Τα μακροφάγα παρουσίαζαν μια μικρή, στατιστικά μη σημαντική, αύξηση στην έκφραση της bcl-2 επί ΙΠΙ. ∆εν παρατηρήθηκε έκφραση της bcl-2 στα λεμφοκύτταρα ασθενών με ΙΠΙ σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου, όπου η συγκεκριμένη πρωτεΐνη εκφραζόταν στο ένα τρίτον περίπου των περιπτώσεων. Στις περιπτώσεις ασθενών με σαρκοείδωση παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική (p<0,001) αύξηση στην έκφραση της bcl-2 τόσο στα λεμφοκύτταρα όσο και στα μακροφάγα του BAL σε σχέση πάντα με την ομάδα ελέγχου. Αντίθετα δεν διαπιστώθηκε έκφραση της bcl-2 επί των πολυμορφοπυρήνων και ηωσινοφίλων τόσο στην ομάδα των ασθενών με σαρκοείδωση, όσο και σε εκείνη των φυσιολογικών ατόμων. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων της παρούσης μελέτης καταδεικνύει την υπερέκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης bcl-2 (σε στατιστικά σημαντικό ποσοστό) στα πολυμορφοπύρηνα και ηωσινόφιλα του BAL επί ΙΠΙ και στα λεμφοκύτταρα και μακροφάγα επί πνευμονικής σαρκοειδώσεως, ουσιαστικά δηλαδή στα κύτταρα που διαμορφώνουν το ιδιαίτερο ''κυτταρικό προφίλ'' της κυψελιδίτιδας σε κάθε ένα εκ των νοσημάτων αυτών. Το εύρημα αυτό πιθανότατα σχετίζεται με τους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς του κάθε νοσήματος, αφού αντίσταση ενός κυττάρου στην απόπτωση σημαίνει επιμήκυνση της ζωής του και αντίσταση στο σύνολο των παραγόντων εκείνων που προάγουν τον φυσιολογικό του θάνατο. Επιπρόσθετα, η μελέτη της bcl-2 πέρα από τα στοιχεία που δίνει για τα παθοφυσιολογικά δρώμενα σε κυψελιδικό επίπεδο θα μπορούσε να αποτελέσει χρήσιμο δείκτη της ενεργότητας της νόσου (ΙΠΙ είτε σαρκοείδωση) αλλά και πιθανής ανταπόκρισης αυτής σε τυχόν εφαρμοζόμενη θεραπευτική αγωγή.