Γενετική ανάλυση της αλληλουχίας μικροδορυφορικού DNA σε δερματικές νεοπλασματικές αλλοιώσεις

Abstract

Cancer cells are defined by two heritable properties: they reproduce in defiance of the normal restraints and they invade and colonize territories normally reserved for other cells. Tumor suppressor genes are a large group of inhibitory genes that participate in carcinogenesis with a non-dominant effect. Non-melanoma skin cancers, squamous cell carcinomas (SCC) and basal cell carcinomas (BCC), are the most common neoplasias of the Caucasian population. In the present PhD thesis we performed an in vitro analysis of the genetic and molecular characteristics of non-melanoma skin tumors and pre-cancerous lesions (BCC, SCC, Bowen’s Disease) in order to determine the involvement of INK4a-ARF tumor suppressor genes p16INK4a, p15INK4b and p14ARF in the development of sporadic non-melanoma skin cancer of Greek patients. An allelic imbalance analysis (loss of heterozygosity, LOH and microsatellite instability, MI), as well as, a mutational analysis were performed. For chromosome locus 9p21-p22 the overall frequency of BCC LOH reached 60% and it is the highest reported in the international literature. In addition, the LOH frequency found for SCC and Bowen’s Disease specimens was also high, reaching 52%. 9p LOH appears to be equally involved in both BCC and SCC tumors. MI was rare in both SCC and BCC specimens. Exons 1α, 1β and 2 of the INK4a-ARF locus were screened for mutations. A Val28Gly substitution in exon 1α and a CCC→TTT (Ala57Val and Arg58Ter) substitution in exon 2, resulting in an early termination of the amino acid sequence are reported for the first time in two SCCs, the latter being indicative of a combination of a UV radiation-induced mutation and a point mutation. A previously described polymorphism of the p16INK4a gene, Ala148Thr, was also detected in 5 BCC and 1 SCC specimens in an overall allelic frequency of 3.72%. The elevated LOH frequency confined in locus 9p21-p22, as well as the detection of polymorphism in the p16INK4a gene in a proportion of human BCC tumors provide strong evidence of genetic alteration on the given locus. Thus, inactivation of the p16INK4a gene, or of another/others yet unidentified tumor suppressor gene/s located on this chromosome region, probably have involvement in the carcinogenesis of at least some human BCC. The detected mutations combined with the high frequency of 9p LOH found in our SCC tumors imply that inactivation of INK4a-xvARF locus’s tumor suppressor genes p16INK4a and p14ARF, via allelic loss and/or mutation (possibly UV induced) could play a significant role in non-melanoma skin cancer development, particularly in the more aggressive SCC type.

Το κύριο χαρακτηριστικό του καρκινικού κυττάρου είναι η ανυπακοή του στους θεμελιώδεις κανόνες ελέγχου των φυσιολογικών κυττάρων με αποτέλεσμα, αφενός, τον αυτόνομο και ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό του, και αφετέρου, την κατάληψη περιοχών που φυσιολογικά ανήκουν σε άλλα κύτταρα. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια συγκροτούν μια μεγάλη ομάδα γονιδίων που συμμετέχουν στη διαδικασία της καρκινογένεσης με τρόπο υπολειπόμενο. Το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα (BCC), και το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC) του δέρματος αποτελούν τους δύο πιο διαδεδομένους καρκίνους της καυκάσιας φυλής. Στην παρούσα διατριβή επί διδακτορία έγινε in vitro ανάλυση σε μοριακό επίπεδο των γενετικών χαρακτηριστικών καρκινικών και προ-καρκινικών όγκων του δέρματος (BCC, SCC, v. Bowen) με στόχο τη διερεύνηση του ρόλου του γονιδιακού τόπου INK4a-ARF (στον οποίο εδράζονται τα ογκοκατασταλτικά γονίδια p16INK4a, p15INK4b και p14ARF) στην ανάπτυξη και εμφάνιση του σποραδικού μη-μελανοκυτταρικού καρκίνου του δέρματος σε Έλληνες ασθενείς. Η διερεύνηση έγινε μέσω ανάλυσης της αστάθειας αλληλουχίας μικροδορυφορικού DNA (loss of heterozygosity, LOH και microsatellite instability, MI) και μέσω ανίχνευσης μεταλλάξεων. Το φαινόμενο της απώλειας ετεροζυγωτίας στην περιοχή 9p21-p22 ανιχνεύθηκε στο υψηλότερο ποσοστό που έχει αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία για τα BCC (60%), ενώ υψηλό ποσοστό ανιχνεύθηκε αντιστοίχως και για τα SCC και v. Bowen (52%). Το μοτίβο εμφάνισης LOH στο χρωμοσωμικό σκέλος 9p φαίνεται να είναι παρόμοιο τόσο στα SCC, όσο και στα BCC. Το φαινόμενο της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA ανιχνεύθηκε σε χαμηλά ποσοστά τόσο στα BCC όσο και στα SCC. Τα εξόνια 1α, 1β και 2 του τύπου INK4a-ARF διερευνήθηκαν για μεταλλάξεις. Η αντικατάσταση μια βαλίνης από μια γλυκίνη στο κωδικόνιο 28 του εξονίου 1α (Val28Gly) και η τριπλή αντικατάσταση CCC→TTT που οδηγεί στην αντικατάσταση μιας αλανίνης από μια βαλίνη στο κωδικόνιο 57 και μετατρέπει την αργινίνη του κωδικονίου 58 σε κωδικόνιο τερματισμού στο εξόνιο 2 διακόπτοντας πρόωρα την αλληλουχία των αμινοξέων περιγράφονται για πρώτη φορά σε SCC στη διεθνή βιβλιογραφία. Οι μεταλλάξεις στο εξόνιο 2 είναι υπαινικτικές για επίδραση της UV ακτινοβολίας. Ένας πολυμορφισμός που έχει ήδη περιγραφεί στο γονίδιο p16INK4a, η αντικατάσταση μιας αλανίνης από θρεονίνη στο κωδικόνιο 148 του εξονίου 2 (Ala148Thr) ανιχνεύθηκε σε 5 BCC και 1 SCC σε συνολική συχνότητα 3.72%. Το υψηλό ποσοστό LOH που βρήκαμε στην περιοχή 9p21-p22 υποδηλώνει ότι σημαντικά για την BCC καρκινογένεση ογκοκατασταλτικά γονίδια πιθανόν να εντοπίζονται στην περιοχή αυτή. Η απουσία μεταλλάξεων στα γνωστά γονίδια p16INK4a και p14ARF, σε συνδυασμό με την εμφάνιση LOH στην περιοχή 9p21-p22 όπου αυτά εδράζονται υποδηλώνει ότι αν αυτά ενέχονται στην BCC καρκινογένεση δεν αδρανοποιούνται μέσω μεταλλάξεων. Ενδεχομένως, όμως, νέο/α άγνωστο/α μέχρι στιγμής ογκοκατασταλτικά γονίδια της περιοχής 9p21-p22 να εμπλέκονται στην ανάπτυξη ορισμένων σποραδικών BCC δερματικών όγκων. Οι μεταλλάξεις που ανιχνεύθηκαν στους SCC όγκους, σε συνδυασμό με το υψηλό ποσοστό της απώλειας ετεροζυγωτίας (LOH) που διαπιστώθηκε στο 9p χρωμοσωμικό σκέλος υπονοούν ότι η ανενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων p16INK4a και p14ARF της περιοχής INK4a-ARF, μέσω απώλειας αλληλομόρφου ή/και μετάλλαξης (πιθανόν οφειλόμενης σε UV ακτινοβολία) μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του μη-μελανοκυτταρικού καρκίνου του δέρματος, ιδιαιτέρως στον πιο επιθετικό SCC τύπο.